眼部碱性化学烧伤（Alkali Burn）是眼科急症之一。由于碱性化学物质能溶解脂肪和蛋白质,碱液易于透过角膜向眼内渗透,受损的组织进一步分泌蛋白酶加剧组织细胞的溶解、坏死,反复且难以控制的炎症以及组织粘连、新生血管生长,最终发展为眼部畸形/致盲。尽管临床上采用多种治疗方法,包括:立即灌洗,去除有害物质;药物治疗;早期促进上皮形成、控制炎症蔓延,后期减少瘢痕形成;手术治疗等。但对中重度的角膜碱烧伤,治疗效果欠理想,预后差。因此,探索角膜碱性化学烧伤的炎症发生机制,寻找可能的治疗靶点,是眼科学者一直致力的研究方向。细胞焦亡（Pyroptosis）作为细胞死亡的方式之一,近年逐渐引起广泛关注。与已经发现的死亡方式（如凋亡、坏死）不同,细胞焦亡被认为是伴随炎症反应的程序性裂解性细胞死亡。天然免疫识别损伤或炎症信号后组装、激活炎性小体,产生活化的caspase-1/4/5/11,进而切割gasdermin（GSDMs）家族蛋白及促炎因子前体;产生的GSDMs家族蛋白的N-末端结构域在细胞膜上打孔,成熟的IL-1β、IL-18等炎性因子释放,对邻近细胞产生促炎信号,经过级联放大反应快速启动炎症反应,对组织造成严重损伤。GSDMs家族蛋白是细胞焦亡发生的关键执行者,其包括 GSDMA、GSDMB、GSDMC、GSDMD、GSDME 等,它们在不同的组织器官表达量高低不同,大部分可被炎性caspase切割,被切割的片段发挥打孔作用,破坏细胞膜完整性。其中GSDMD是目前研究最为广泛的焦亡关键蛋白之一,已证实其在糖尿病、肾病及感染性疾病等多种疾病中发挥重要作用。格列本脲是临床常用的磺脲类口服降糖药。除了作为降糖药外,有研究发现在膀胱炎症、鼻窦炎伴鼻息肉等疾病的动物模型中腹腔注射格列本脲,可通过抑制NLRP3炎性小体的激活,减少IL-1β、TGF-β1和TNF-α等促炎细胞因子的表达并减轻炎症反应。但目前仍未见其在眼科抗炎治疗中的应用。实验目的1.探究GSDMD介导的细胞焦亡是否参与角膜碱烧的早期炎症反应;2.探究局部应用格列本脲治疗角膜碱烧伤的效果及其作用机制。实验方法:第一部分:建立小鼠角膜碱烧伤模型,分别在第3天、5天、7天、14天观察并收集角膜组织,采用实时荧光定量PCR技术检测烧伤后角膜组织NLRP3、caspase-1、GSDMD、IL-1β的mRNA水平,同时采用Western Blot检测 NLRP3、caspase-1/caspase-1p20、GSDMD/GSDMD-N、IL-1β/IL-1βcleave的蛋白表达水平。第二部分:（1）血糖检测:比较腹腔注射与不同浓度（100/200/500uM）滴眼时,格列本脲对小鼠血糖的影响。（2）建立小鼠角膜碱烧伤模型,分溶剂滴眼对照组（DP）,100uM滴眼组（G1）,200uM滴眼组（G2）,500uM滴眼组（G5）,共4组。用荧光素钠染色评分及组织HE染色比较各组角膜上皮缺损情况。同时采用实时荧光定量PCR技术检测烧伤后各组角膜组织NLRP3、caspase-1、GSDMD、IL-1β、MMP-9/13 的 mRNA 水平,采用 Western Blot 检测 NLRP3、caspase-1/caspase-1p20、GSDMD/GSDMD-N、IL-1β/IL-1βcleave 的蛋白表达水平,综合评价格列本脲局部应用治疗小鼠角膜碱烧伤的效果。实验结果:1.与空白对照相比,角膜碱烧伤后第3天、5天、7天的角膜组织 NLRP3、caspase-1、GSDMD、IL-1β 的 mRNA 及蛋白表达水平均升高（P＜0.05）,且各因子升高趋势大致相同。2.血糖检测结果显示:与溶剂对照组及不同浓度格列本脲滴眼组相比,格列本脲腹腔注射组血糖水平在用药后6小时明显降低,用药后24小时恢复（P＜0.001）。3.角膜碱烧伤后荧光素钠染色评分及HE染色结果:溶剂对照组荧光素钠染色评分高于格列本脲各浓度滴眼组（P＜0.001）;HE结果提示溶剂对照组角膜上皮缺损较其余各组严重,炎性细胞浸润明显。4.角膜碱烧伤后,格列本脲各浓度滴眼组的NLRP3、caspase-1、GSDMD、IL-1β的mRNA和蛋白水平及基质金属蛋白酶（Matrix metalloproteinase）MMP-9/13的mRNA表达水平较溶剂对照组降低（P＜0.05）。结论:初次发现GSDMD介导的细胞焦亡可能参与角膜碱烧伤后早期炎症反应;格列本脲局部应用可减轻小鼠角膜碱烧伤早期炎症反应,其机制可能与抑制NLRP3炎性小体进而阻止细胞焦亡发生相关。