研究背景和目的梅毒血清固定是指部分患者经过正规驱梅方案治疗后,其快速血浆血清反应素(Rapid plasma region test, RPR)滴度下降至一定水平后不再变化并长期维持低滴度,即称为血清固定。在临床工作中,我们经常会给予梅毒血清固定患者经验性的苄星青霉素治疗。然而,关于苄星青霉素对梅毒血清固定患者疗效的系统研究相对较少。此外,梅毒血清固定的发病机制一直不清楚,有学者认为与机体免疫功能密切相关,其中microRNA可能发挥着重要的调节作用。MicroRNA是一类长度约为21bp的非编码负性调控RNA分子,参与众多重要生理和病理途径,包括炎症反应、组织修复、凋亡、并在宿主抗感染免疫应答中发挥不可替代的调节作用。病原体能够利用nicroRNA进行基因转录后调控,以利于微生物在宿主细胞内的复制和免疫逃逸。目前已经有研究发现microRNA在结核分枝杆菌、幽门螺旋杆菌等感染性疾病的发生和进展过程中扮演着重要的角色,但是有关梅毒螺旋体的研究尚属空白。因此本课题首先从临床角度探讨苄星青霉素治疗梅毒血清固定患者的疗效。其次,从功能基因组学角度出发,运用Illumina测序技术对二期梅毒和梅毒血清固定患者外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell, PBMC) microRNA进行研究,筛选鉴定出特异表达microRNA,并通过生物信息学技术研究其与靶基因及相关调控途径,为揭示梅毒血清固定的发病机制提供有价值的研究思路。研究对象1.疗效评价：从2001年1月—2013年1月期间我院皮肤性病中心有病历记载的697例晚期潜伏梅毒和971例不明病期潜伏梅毒患者中,选择有完整随访记录的70例梅毒血清固定患者资料进行回顾性分析,其中苄星青霉素复治组的患者35例,无任何治疗组患者35例。两组平均年龄均为30岁,性别比例无显著性差异。2. microRNA表达谱的研究：选取2013年6月—2014年6月期间就诊于我院皮肤性病中心并经血清学检测确诊的28例二期梅毒、27例梅毒血清固定患者。同期收集40例健康志愿者作为对照组。三组间性别、年龄无统计学差异。研究方法1.回顾性分析我院性病中心2001年1月—2013年1月期间的有完整随访记录的70例梅毒血清固定患者,将其分为苄星青霉素治疗组(n=35)和对照组(n=35)。治疗组患者予苄星青霉素240万单位肌注,每周1次,一共3次进行复治。对照组患者未予任何治疗。复治12个月后复查RPR滴度以观疗效。以RPR下降≥2个滴度为有效,RPR下降<2个滴度为无效判定结果。2.选取2013年6月—2014年6月期间在我院皮肤科性病中心诊断的二期梅毒、血清固定患者各5例,并收集5例健康志愿者作为对照组,采用新一代高通量测序技术Illumina HiSeq法对15例患者的PBMC样本进行microRNA深度测序研究,分析差异性表达的基因,扩大样本量,收集23例二期梅毒患者、22例梅毒血清固定患者和35例健康志愿者PBMC样本,对显著差异表达的microRNA进行实时荧光定量PCR (Real time-PCR, RT-PCR)验证。利用生物信息学技术进行靶基因预测、Gene Ontology (GO)和KEGG功能注释等分析。结果1.苄星青霉素治疗组中有26例患者治疗有效,9例患者治疗无效,仍保持血清固定,有效率为74.2%；无任何治疗的对照组中有28例患者治疗有效,7例患者治疗无效,有效率为80%,两组差异无统计学意义(P>0.05)。2.所有15个样品均建库成功,并采用Illumina HiSeq高通量测序。二期梅毒、血清固定患者和正常对照组三组间所测的microRNAs表达水平两两对比后,(1)以Rati>1和P<0.05为标准进行筛选,发现二期梅毒与正常对照组间表达差异表达的microRNAs有146个,其中54个上调,92个下调；血清固定组与正常对照组间表达差异表达microRNAs有111个,其中61个上调,50个下调；血清固定组与二期梅毒患者组间表达差异microRNAs有142个,其中88个上调,54个下调。(2)以Ratio≥2口P<0.05为标准进行筛选,发现二期梅毒与正常对照组间表达差异表达的1nicroRNAs有58个,其中33个上调,25个下调；血清固定组与正常对照组间表达差异表达microRNAs有53个,其中40个上调,13个下调；血清固定组与二期梅毒患者组间表达差异microRNAs有49个,其中32个上调,17个下调。同时预测得到新的microRNA数目为657种。3.扩大样本量,收集23例二期梅毒、22例梅毒血清固定患者和35例健康志愿的PBMC标本,选择测序结果中差异表达显著的13种microRNA, 对 miR-299-3p、 miR-451a、miR-548j-3p、miR-654-5p、miR-3135b、miR-338-5p、Novel-5、Novel-62、 Novel-73、Novel-124、Novel-128、Novel-163 和 Novel-244 行 RT-PCR分析后发现Novel-128 和 Novel-244在二期梅毒和梅毒固定患者PBMC中表达均降低,Novel-163只在二期梅毒中降低,而Novel-5表达升高,miR-338-5p只在梅毒血清固定患者中表达升高。4.根据GO和KEGG富集分析结果显示二期梅毒与血清固定患者差异表达的microRNA预测调控的靶基因显著性功能包含许多种,涉及到代谢(糖、蛋白质修饰)、生长(细胞增殖及增殖中的正、负调控、细胞周期、细胞周期阻滞)、分化、凋亡(细胞凋亡、抗凋亡、诱导凋亡、凋亡抑制)、信号转导等多方面功能；同时,这些靶基因涉及的通路途径包括：代谢途径(固醇类生物合成、糖原合成途径、脂肪酸合成、嘌呤、嘧啶合成途径)、细胞生长途径(细胞周期)、连接途径(黏附连接、紧密连接)等,细胞周期、细胞黏附等。5.Novel-224与miR-338-5p呈正相关,Novel-5与Novel-128、miR-338-5p和Novel-163均呈正相关,提示microRNA之间也存在一定表达或功能相关性。结论1.我们用苄星青霉素复治晚期潜伏梅毒和不明病期潜伏梅毒的血清固定患者,治疗组的35例患者中有26例有效,而未复治的对照组中也有28例患者出现RPR滴度的下降,两组疗效统计学上无差异,故其有效性还有待进一步观察,同时结果显示梅毒血清固定患者RPR滴度可随着时间的延长而逐渐降低。2.梅毒血清固定患者外周血单个核细胞具有特异的microRNA表达谱。miR-338-5p. Novel-163、Novel-128、Novel-244和Novel-5在梅毒血清固定患者中差异表达并具有相关性,有可能作为评价治疗的指标。3. miR-338-5p、Novel-163、Novel-128、Novel-244和Novel-5及其靶基因与二期梅毒多种生物学功能,如T细胞受体信号通路、代谢、生长密切相关。