【摘 要】
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目的:验证联合靶向NUAK1与ULK1激酶的协同抗肿瘤作用,验证双靶向NUAK1/ULK1的多靶点抑制剂MRT68921杀伤肿瘤细胞的活性及机制研究。材料与方法:1.通过TCGA数据库分析NUAK1与ULK1在肿瘤患者标本中表达量的相关性。2.Western blot验证NUAK1抑制剂或siRNA处理后肿瘤细胞自噬相关信号通路的表达量变化。3.Annexin V/PI与DCFH-DA染色后用流式
【基金项目】
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广东省省级科技计划项目（2016A020213005）； 广州市科技计划项目（201704020216）； 广东省省级科技计划项目（2017A020215183）；
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目的:验证联合靶向NUAK1与ULK1激酶的协同抗肿瘤作用,验证双靶向NUAK1/ULK1的多靶点抑制剂MRT68921杀伤肿瘤细胞的活性及机制研究。材料与方法:1.通过TCGA数据库分析NUAK1与ULK1在肿瘤患者标本中表达量的相关性。2.Western blot验证NUAK1抑制剂或siRNA处理后肿瘤细胞自噬相关信号通路的表达量变化。3.Annexin V/PI与DCFH-DA染色后用流式细胞术检测NUAK1与ULK1抑制剂联合使用对肿瘤细胞凋亡水平及ROS水平的影响。4.Western blot验证NUAK1与ULK1抑制剂联用对肿瘤自噬、凋亡信号通路的影响。5.CCK-8验证NUAK1抑制剂与ULK1抑制剂的协同作用。6.使用MOE对NUAK1进行同源模建并优化。7.使用MOE的dock模块将已知的NUAK1抑制剂（WZ4003和HTH-01-015）与构建的NUAK1进行虚拟对接。8.CCK-8验证MRT68921对多种肿瘤细胞的杀伤作用。9.克隆平板实验验证MRT68921对肿瘤克隆形成能力的影响。10.Annexin V/PI与DCFH-DA染色后用流式细胞术检测MRT68921对肿瘤细胞凋亡水平及ROS水平的影响。11.Western blot验证MRT68921对自噬及凋亡通路的影响。12.划痕实验及Transwell侵袭小室验证MRT68921对肿瘤迁移与侵袭的影响。13.构建NCI-H460的裸鼠皮下移植瘤模型,验证MRT68921的体内抗肿瘤活性。14.构建MNK45的裸鼠皮下移植瘤模型,验证MRT68921的体内抗肿瘤活性。15.构建小鼠乳腺癌肺转移模型,验证MRT68921抑制乳腺癌肺转移的活性。16.反向虚拟筛选MRT68921的作用靶点。结果:1.NUAK1与ULK1在肿瘤组织中的表达量具有显著相关性。靶向抑制NUAK1会导致ULK1依赖的自噬水平提高,联合ULK1抑制剂后产生显著的协同杀伤作用,导致肿瘤细胞ROS水平增高,细胞凋亡。WZ4003与SBI-0206965在多个浓度梯度产生较强协同作用,而WZ4003与MRT68921并未产生较强协同作用,MRT68921单药即具有显著的抗肿瘤活性。2.以MARK4为同源模板成功构建NUAK1的晶体结构,通过虚拟对接发现已知NUAK1抑制剂（WZ4003与HTH-01-015）以及MRT68921均可结合于NUAK1同一活性口袋,提示MRT68921对NUAK1激酶活性的抑制作用。3.MRT68921可以显著杀伤多种肿瘤细胞,促进肿瘤细胞凋亡,提高ROS水平,抑制肿瘤细胞侵袭与迁移能力,显著抑制裸鼠皮下移植瘤的生长,减少小鼠乳腺癌肺转移能力,延长小鼠总生存期。4.通过反向虚拟筛选,发现MRT68921的潜在作用谱,其中,MRT68921与谷胱甘肽代谢系统关键酶有较强的亲和力。结论:双靶向NUAK1与ULK1是一种可行的药物联合方式,NUAK1/ULK1双靶点抑制剂MRT68921在体内或体外均具有显著的抗肿瘤活性。本研究所构建的NUAK1同源模型,能与已报道的NUAK1抑制剂及MRT68921稳定对接,为未来筛选强效、特异的NUAK1抑制剂提供工作基础。
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