论文部分内容阅读
研究目的1.证实Mst1能够调控非酒精性脂肪性肝纤维化相关基因和蛋白的表达;2.证实LBP可能通过靶向Mst1调控非酒精性脂肪性肝纤维化相关基因和蛋白的表达而为临床治疗提供新的策略和靶点。研究方法1.选用人肝星状细胞LX-2与人肝癌细胞Hep G2,分别给予100μM、200μM、400μM棕榈酸（PA）处理及2 ng/m L、5 ng/m L、10 ng/m L转化生长因子-β1（TGF-β1）处理,均处理24 h,随后利用MTT细胞毒性实验检测细胞存活率,通过油红O染色检测细胞脂肪变性,通过Western blot实验与q RT-PCR实验检测细胞纤维化因子α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）及Ⅰ型胶原蛋白（CollagenⅠ）的蛋白及m RNA表达水平。2.采用si Mst1转染正常培养或TGF-β1诱导的LX-2细胞24 h,通过Western blot实验对细胞中Mst1、p Smad2/3、Smad2/3、α-SMA及CollagenⅠ的蛋白表达水平进行检测;通过q RT-PCR实验对细胞中Mst1、Smad3、CollagenⅠ、Smad4、α-SMA的m RNA表达水平进行检测。3.采用pCDH-Mst1过表达质粒转染正常培养或TGF-β1诱导的LX-2细胞24 h,通过Western blot实验对细胞中Mst1、p Smad2/3、Smad2/3、α-SMA及CollagenⅠ的蛋白表达水平进行检测;通过q RT-PCR实验对细胞中Mst1、Smad3、CollagenⅠ、Smad4、α-SMA的m RNA表达水平进行检测。4.给予不同剂量LBP干预正常培养或TGF-β1诱导的LX-2细胞24 h,通过MTT细胞毒性实验检测细胞存活率;通过Western blot实验对细胞中Mst1、CollagenⅠ及α-SMA的蛋白表达水平进行检测;通过q RT-PCR实验对细胞中Mst1、CollagenⅠ与α-SMA的m RNA表达水平进行检测。5.给予相同剂量LBP干预正常培养或TGF-β1诱导的LX-2细胞,在不同时间点收集细胞进行分析,通过MTT细胞毒性实验检测细胞存活率;通过Western blot实验对细胞中Mst1、CollagenⅠ及α-SMA的蛋白表达水平进行检测;通过q RT-PCR实验对细胞中Mst1、CollagenⅠ与α-SMA的m RNA表达水平进行检测。6.采用LBP干预si Mst1转染TGF-β1诱导的LX-2细胞24 h,通过MTT细胞毒性实验检测细胞存活率;通过Western blot实验对细胞中Mst1、p Smad2/3、Smad2/3、α-SMA及CollagenⅠ的蛋白表达水平进行检测;通过q RT-PCR实验对细胞中Mst1、Smad3、CollagenⅠ、Smad4、α-SMA的m RNA表达水平进行检测。7.采用LBP干预pCDH-Mst1过表达质粒转染TGF-β1诱导的LX-2细胞24 h,通过MTT细胞毒性实验检测细胞存活率;通过Western blot实验对细胞中Mst1、p Smad2/3、Smad2/3、α-SMA及CollagenⅠ的蛋白表达水平进行检测;通过q RT-PCR实验对细胞中Mst1、Smad3、CollagenⅠ、Smad4、α-SMA的m RNA表达水平进行检测。研究结果1.分别采用PA和TGF-β1诱导LX-2细胞与Hep G2细胞,成功构建脂肪性肝纤维化模型使用100μM、200μM、400μM PA及2 ng/m L、5 ng/m L、10 ng/m L TGF-β1分别诱导LX-2细胞、Hep G2细胞24 h,MTT实验结果显示PA、TGF-β1诱导Hep G2、LX-2细胞后细胞存活率均随诱导因子浓度的升高而显著降低（P<0.01）,其中PA诱导组相较TGF-β1诱导组对Hep G2、LX-2细胞存活率抑制更明显;油红O染色结果显示,PA诱导组Hep G2、LX-2细胞内脂滴含量随PA浓度的升高显著增多,TGF-β1诱导组中LX-2细胞内脂滴含量随TGF-β1浓度的升高而增多;Western blot实验结果显示,200μM、400μM PA诱导Hep G2细胞后细胞内α-SMA及CollagenⅠ的蛋白表达水平显著上调（P<0.01）,5 ng/m L、10 ng/m L TGF-β1诱导后LX-2细胞内α-SMA、CollagenⅠ蛋白表达水平显著上调（P<0.01）;q RT-PCR结果显示,200μM PA诱导后Hep G2细胞内α-SMA、CollagenⅠm RNA表达水平显著升高（P<0.01）,5 ng/m L、10 ng/m L TGF-β1诱导后LX-2细胞内α-SMA、CollagenⅠm RNA表达水平显著上调（P<0.01）。上述结果表明,200μM、400μM PA诱导对Hep G2、LX-2细胞毒性较大,5 ng/m L、10 ng/m L TGF-β1诱导LX-2细胞可见细胞内脂滴形成,对比后选择10 ng/m L TGF-β1诱导LX-2细胞24 h作为脂肪性肝纤维化细胞模型进行后续实验。2.Mst1能够调控非酒精性脂肪性肝纤维化相关因子的蛋白与m RNA表达采用pCDH-Mst1过表达质粒转染肝纤维化模型细胞24 h,Western blot及q RT-PCR结果显示,与对照组相比,Mst1过表达可以减少细胞内肝纤维化相关因子α-SMA、CollagenⅠ、p Smad 2/3蛋白与α-SMA、CollagenⅠ、Smad 3、Smad 4的m RNA的表达水平（P<0.01）。采用si Mst1转染TGF-β1诱导后的LX-2细胞,Western blot及q RTPCR结果显示,与对照组相比,细胞内肝纤维化相关因子CollagenⅠ、p Smad 2/3蛋白表达上调（P<0.01）,细胞内α-SMA m RNA的表达水平升高（P<0.01）,细胞内CollagenⅠ、Smad 4 m RNA的表达水平均升高（P<0.05）。3.LBP以浓度或时间依赖性增加Mst1蛋白与m RNA的表达使用0μg/m L、100μg/m L、300μg/m L、600μg/m L、900μg/m L LBP分别孵育LX-2细胞6 h、12 h、24 h、48 h,MTT实验结果显示,LX-2细胞存活率随LBP浓度升高而降低（P<0.01）,选择600μg/m L LBP孵育LX-2细胞,细胞存活率随孵育时间的升高而降低（P<0.01）;使用0μg/m L、100μg/m L、300μg/m L、600μg/m L、900μg/m L LBP分别孵育LX-2细胞24 h,Western blot实验及q RT-PCR实验结果显示300μg/m L、600μg/m L、900μg/m L LBP能够增加Mst1蛋白的表达,且600μg/m L浓度时效果最佳（P<0.01）;使用600μg/m L LBP分别孵育LX-2细胞6 h、12 h、24 h、48 h,Western blot实验及q RT-PCR实验结果均显示LBP以时间依赖性增加Mst1蛋白与m RNA的表达（P<0.01）。上述结果表明,LBP在600μg/m L浓度时能够明显增加Mst1蛋白与m RNA的表达,所以选择600μg/m L LBP干预24 h进行后续实验。4.LBP通过影响Mst1调控非酒精性脂肪性肝纤维化相关因子的蛋白与m RNA表达采用600μg/m L LBP孵育已转染Mst1 si RNA及Mst1过表达的肝纤维化细胞模型,Western blot实验结果显示,与对照组相比,Mst1过表达后细胞内肝纤维化相关因子α-SMA、CollagenⅠ、p Smad 2/3及Smad 2/3的蛋白表达水平明显降低（P<0.01）,q RT-PCR结果显示,细胞内α-SMA、CollagenⅠ、Smad3及Smad 4的m RNA表达水平明显降低（P<0.01）;在转染si Mst1后,Western blot实验结果显示,与对照组相比细胞内α-SMA、CollagenⅠ、p Smad 2/3、Smad 2/3的蛋白表达水平明显上调（P<0.01）,q RT-PCR结果显示细胞内α-SMA、CollagenⅠ、Smad3及Smad 4的m RNA表达水平明显上调（P<0.01）。我们发现LBP能够通过显著增加Mst1的表达,调控非酒精性脂肪性肝纤维化相关基因和蛋白的表达。研究结论1.Mst1能够抑制非酒精性脂肪性肝纤维化相关基因和蛋白的表达;2.LBP可能通过靶向Mst1调控非酒精性脂肪性肝纤维化相关基因和蛋白的表达而为临床治疗提供新的策略和靶点。