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抗菌肽是鱼体天然免疫体系中的重要组成部分,它属于非特异性免疫,能够迅速地在体内合成并扩散,抵御病原微生物侵害,其反应速度是特异性免疫系统所不可比拟的,因此在鱼害疾病的防治,鱼类品种的改良等方面,抗菌肽能够开辟出一条新的研究途径。本试验应用SephadexLH-20凝胶层析,RP-HPLC等分离技术对草鱼肠道抗菌肽进行分离纯化并对其基本的理化性质进行了研究。1.草鱼肠道抗菌肽的分离与纯化本实验将新鲜草鱼肠道经充分破碎后,再经超声波处理、5%乙酸浸提,冻干,SephadexLH-20凝胶过滤层析,收集样品冷冻真空干燥后,以0.1 mol/L乙酸铵溶液作为空白对照,作抑菌活性检测,其中具有抗菌活性的成分利用高效液相色谱分析,收集各组分冻干,并用牛津杯扩散法及纸片扩散法检测各组分的抗菌活性。通过改变反相高效液相色谱洗脱条件对草鱼肠道抗菌肽进行进一步分离,得到纯度更高的抗菌肽样品,纯化后抗菌肽冷冻真空干燥,4℃,保存。2.草鱼肠道抗菌肽抗菌活性鉴定及理化性质的研究采用纸片扩散实验检测草鱼肠道抗菌肽对致病性大肠杆菌(pathogenic Escherichia coli)、致病性金黄色葡萄球菌(pathogenic Staphyloccocus aureus)、鱼致病性沙门氏菌(Salmonella)、鱼致病性嗜水气单胞菌(Aeromonas Hydrophila)、鱼害粘球菌(Myxococcus piscicola)、巴氏杆菌(Pasteurella)、链球菌(Streptococcus)等7株细菌的抗菌作用。结果表明,草鱼肠道抗菌肽对金黄色葡萄球菌作用一般外,对以上其他6株菌株均有较强的抑制或杀灭作用。将大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、嗜水气单胞菌与草鱼肠道抗菌肽在37℃下作用30 min,扫描电镜下观察草鱼肠道抗菌肽对这三株细菌形态结构的影响。结果显示,草鱼肠道抗菌肽作用于细菌细胞膜,导致细菌表面出现囊泡状或不规则突起样结构,细菌严重变形、扭曲、表面变得粗糙、皱缩、胞膜破裂、内容物外泄而死。草鱼肠道抗菌肽分别用不同的温度处理30 min之后,检测其抗菌活性。实验结果表明,经过高温处理的草鱼肠道抗菌肽样品的抗菌活性基本没有发生改变,因此认为该抗菌肽具有良好的热稳定性。利用胰蛋白酶对草鱼肠道抗菌肽进行酶切16h,然后通过RP-HPLC系统对酶切后产物进行回收,并做抗菌活性的检测。结果显示,在经过胰蛋白酶酶切后的抗菌肽样品在RP-HPLC中的保留时间基本未发生改变,同时,回收样品的抗菌实验中,样品依然具有很好的抗菌活性,我们可以认为该抗菌肽物质在蛋白酶作用下,一级结构没有发生变化,可能是由于该抗菌肽缺乏胰蛋白酶作用位点或者该类抗菌肽具有耐蛋白酶酶切特性。3.草鱼肠道抗菌肽的氨基酸序列分析通过凝胶层析和反相液相色谱纯化得到的草鱼肠道抗菌肽样品进行MALDI-TOF-MS分析,样品分子量约为2762 Da。蛋白质N-端氨基酸序列分析,在预实验的过程中,发现N-端氨基酸序列分析过程中,出现多次Asn、Ser、Thr等信号,推断在该抗菌肽氨基酸序列中存在Asn、Ser、Thr等蛋白质糖基化位点存在。利用去糖基化试剂盒处理纯化得到的抗菌肽样品进行去糖基化处理后回收目的肽,冷冻真空干燥后,进行蛋白质N-端氨基酸序列分析,得到一条含有30个氨基酸的N-端序列VKGLVGFAGRRGPPGPRGPVGPAGAKGHQG,通过APD数据库对该序列进行分析和比对,发现该抗菌肽N-端氨基酸序列与其相似度较高的5种抗菌肽分别是意大利蜂Apis mellifera L中发现的ABAECIN,相似度为40.54%,从乳酸菌Lactobacillus salivarius DPC6005、Lactobacillus salivarius subsp. salivarius UCC118中纯化得到的Salivaricin P、ABP-118,相似度为36.95%,从白纹伊蚊mosquito, Aedes albopictus中发现的Cecropin C,相似度为36.84%；从猪唾液腺中分离纯化到porcine proline-rich antifungal peptide SP-B,相似度为36.66%。