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急性细菌性脑膜炎是危及生命的严重感染,具有很高的致死率和致残率。目前肺炎链球菌是常见的致病菌,全世界每年约有近600,000肺炎链球菌脑膜炎患者,致死率高达34%,幸存者50%具有神经心理、听力等障碍。近几十年随着抗生素不断问世,预后有所改善。但是抗菌素不能阻止细菌溶解释放出的毒性物质诱导的炎症反应,病情依然持续进展。肺炎链球菌溶血素(pneumolysin,PLY)是肺炎链球菌重要的毒力因子,细菌溶解后释放,具有多种功能,能触发炎症反应、诱导细胞凋亡,甚至直接损伤神经元,引起大脑严重损害。因此深入研究PLY致感染性脑损伤的发病机制,寻找有效措施与抗菌素联合应用尤为重要。褪黑素(1melatonin, MT)是一种由松果腺体分泌的吲哚类神经内分泌物质,有很高的中枢神经系统亲和性,能够穿越血脑屏障。神经元和胶质细胞膜上都有褪黑素受体的表达。褪黑素与其特异受体结合产生生物效应,具有抗氧化、抗炎、抗凋亡以及基因调节等作用。褪黑素对多种神经系统疾病如阿尔茨海默病、癫痫、新生大鼠缺血缺氧脑损伤有预防和保护作用。但是在感染性脑损伤中的研究报道较少。细胞凋亡是指机体正常细胞在受到生理性或病理性刺激后启动的自发的死亡过程,与神经系统后遗症具有密切关系。凋亡诱导因子(apoptosis inducing factor,AIF)是一类保守的黄素蛋白,存在于线粒体内外膜间隙,在外界凋亡信号刺激下,AIF可转移到细胞核,诱导核染色质浓缩和非依赖半胱天冬酶的DNA断裂,介导脑细胞凋亡,在感染性脑损伤中扮演着重要角色。高迁移率族蛋白B1(high mobility group box1,HMGB1)为细胞内的一种高度保守的非组蛋白,首先发现于脑内,在体内广泛分布。主要存在于胞核,其生物学功能是参与DNA修复与重组、核小体稳定、细胞分化及类固醇激素调控等。并且具有细胞因子样的功能,是一种重要的具有临床意义的炎症介质。有关HMGB1与肺炎链球菌脑膜炎的研究尚未见报道。因此本研究拟在建立肺炎链球菌溶血素诱导感染性脑损伤的基础上,监测脑细胞凋亡、AIF和HMGB1的表达,并予以褪黑素干扰,从凋亡和炎症反应两方面探讨MT对感染性脑损伤的保护作用机制。第一部分肺炎链球菌溶血素致大鼠脑损伤模型的建立目的经颈内动脉注射肺炎链球菌溶血素建立感染性脑损伤动物模型。方法随机将56只幼鼠分成两组：对照组(NS组,n=28),通过左侧颈内动脉注射0.2mL生理盐水；溶血素组(PLY组,n=28),通过左侧颈内动脉注射0.2mL(7μg) PLY。各组均按观察时间点不同分为2个亚组(24h、48h),每亚组均有14只。各组动物观察到相应时间点处死,提取脑组织标本进行检测。采用甲酰胺法测定伊文思兰(EB)含量,脑组织含水量(BWC)的测定采用干湿重法,免疫组织化学技术(SP法)测定脑内神经元特异性烯醇化酶(NSE)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)蛋白表达情况。结果PLY组脑组织病理改变明显,HE染色光镜下可见PLY组血管间隙不同程度的增宽,炎性细胞趋化浸润,肿胀的胶质细胞和神经元、甚至空泡变性,24h改变较48h明显。NS组没有上述病理变化。PLY组24h脑组织EB、BWC含量以及NSE、GFAP蛋白含量高于48h(P<0.05)。PLY组各时间点脑组织EB、BWC含量以及NSE、GFAP蛋白含量均高于NS组,差异有统计学意义(P<0.01)。结论经幼年大鼠颈内动脉注射PLY脑组织病理改变明显,EB、BWC含量以及NSE、GFAP蛋白含量增高,注射后24h损伤较48h重。表明感染性脑损伤动物模型建立成功。第二部分褪黑素对肺炎链球菌溶血素致大鼠脑损伤细胞凋亡的影响目的探讨褪黑素对肺炎链球菌溶血素致幼年大鼠感染性脑损伤中细胞凋亡的影响,并对其作用机制进行探讨。方法将84只幼鼠随机分成三组：(1)NS组28只,通过左侧颈内动脉注射0.2mL生理盐水；(2)PLY组28只,通过左侧颈内动脉注射0.2mL (7μg) PLY;(3) MT组28只,腹腔注射0.1%MT(10mg/kg)15min后颈内动脉注射0.2mL(7μg) PLY。每组按照注射后观察时间点的不同(24h、48h)分为2个亚组,每亚组均14只。各组动物观察到相应时间点处死,提取脑组织标本进行检测。采用甲酰胺法测定EB含量,BWC的测定应用干湿重法,免疫组织化学技术测定脑内NSE、 GFAP蛋白表达情况。免疫组织化学技术测定脑内凋亡诱导因子蛋白表达情况,原位末端标记法(TUNEL法)检测细胞凋亡。结果HE染色光镜下可见PLY组血管间隙不同程度的增宽,炎性细胞趋化浸润,肿胀的胶质细胞和神经元、甚至空泡变性。NS组没有上述病理变化。MT组大鼠脑组织改变较PLY组轻。PLY注射后24h EB、BWC含量、NSE、GFAP、AIF蛋白含量明显增加,48h稍降低：凋亡细胞数在24h也明显增加,在48h时达高峰。各时间点与NS组比较差异显著。MT组各时间点脑组织EB含量、NSE、 GFAP、AIF蛋白含量均降低,凋亡细胞数也低于PLY组,但高于生理盐水组,差异有统计学意义。MT组24h脑组织BWC含量高于NS组(P<0.05),48h比较无明显差异。结论神经细胞凋亡参与了PLY致大鼠脑损伤的发展过程,凋亡诱导因子可能介导了神经细胞的凋亡。MT对PLY致大鼠脑损伤有保护作用,可能与降低脑内凋亡诱导因子表达,减少神经细胞凋亡有关。第三部分褪黑素对肺炎链球菌溶血素致大鼠脑损伤高迁移率族蛋白B1的影响目的探讨高迁移率族蛋白B1在肺炎链球菌溶血素致幼年大鼠脑损伤中的表达变化以及褪黑素对其影响。方法将84只幼鼠随机分成三组：(1)NS组28只,通过左侧颈内动脉注射0.2mL生理盐水；(2)PLY组28只,通过左侧颈内动脉注射0.2mL (7μg) PLY;(3) MT组28只,腹腔注射0.1%MT(10mg/kg)15min后颈内动脉注射0.2mL(7μg) PLY。每组按照注射后观察时间点的不同(24h、48h)分为2个亚组,每亚组均14只。各组动物观察到相应时间点处死,提取脑组织标本进行检测。采用甲酰胺法测定EB含量,BWC的测定应用干湿重法,免疫组织化学技术测定NSE、 GFAP蛋白表达情况。免疫组织化学技术测定脑内HMGB1蛋白表达情况,RT-PCR技术检测HMGB1mRNA的表达变化。结果HE染色光镜下可见PLY组血管间隙增宽,大脑皮质可见炎性细胞浸润,胶质细胞和神经元不同程度肿胀、空泡变性。NS组没有上述病理变化。MT组大鼠脑组织改变较PLY组轻。PLY注射后24h、48h时间点脑组织BWC、EB含量、NSE、GFAP、HMGB1蛋白含量、HMGB1mRNA均增加,各时间点与NS组比较均有显著性差异。MT组24h、48h时间点脑组织EB含量、NSE、GFAP、HMGB1蛋白含量、HMGB1mRNA表达量均低于PLY组,高于生理盐水组,差异有统计学意义。MT组24h BWC含量、HMGB1mRNA表达量高于NS组(P<0.05),48h比较无明显差异。结论HMGB1参与了PLY诱导的幼年大鼠脑损伤的发展过程。MT对PLY致脑损伤有保护作用,可能与减少HMGB1的表达,减轻脑内炎症反应有关。