【摘 要】
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目的:结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis,M.tuberculosis）的Rv0242c基因编码3-氧酰基-ACP还原酶4（Fab G4）,在分枝杆菌属中保守,推测参与2型脂肪酸合成途径（fatty acid synthetic pathway typeⅡ,FAS-Ⅱ）,进而参与合成分枝菌酸与索状因子,影响细菌的生物学特性与致病性。耻垢分枝杆菌（Mycobacter
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目的:结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis,M.tuberculosis）的Rv0242c基因编码3-氧酰基-ACP还原酶4（Fab G4）,在分枝杆菌属中保守,推测参与2型脂肪酸合成途径（fatty acid synthetic pathway typeⅡ,FAS-Ⅱ）,进而参与合成分枝菌酸与索状因子,影响细菌的生物学特性与致病性。耻垢分枝杆菌（Mycobacterium smegmatis,M.smegmatis）mc2 155菌株的MSMEG＿0372为Rv0242c的直系同源基因。为了初步探索Fab G4的功能,我们研究了MSMEG＿0372在M.smegmatis中的作用。方法:1.通过生物信息学方法分析M.smegmatis mc2 155菌株中MSMEG＿0372基因遗传组织图及其与M.tuberculosis H37Rv菌株中Rv0242c的基因和蛋白的同源性。2.通过聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）扩增MSMEG＿0372基因,构建p MV361-MSMEG＿0372质粒。将p MV361-MSMEG＿0372质粒导入M.smegmatis mc2 155野生型（wild-type,WT）菌株,构建MSMEG＿0372基因过表达（overexpression,OE）菌株。3.在振荡培养或静置培养条件下,通过绘制WT菌株及由其构建的MSMEG＿0372基因敲除（knockout,KO）、回补（complementation,COM）和OE菌株的生长曲线,比较各菌株的生长速度。4.通过观察各菌株在LB（Luria-Bertani）培养基和MB7H10培养基上形成的菌落形态,菌落结合刚果红的能力以及滑动性能（sliding motility）,比较各菌株的生长特性。5.通过结晶紫（crystal violet,CV）染色定性或定量比较各菌株生物膜的特点和总量。6.用扫描电子显微镜（scanning electron microscopy,SEM）观察各菌株细菌细胞壁表面的超微结构。用气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS）检测各菌株细菌的脂肪酸的含量。用高效液相色谱（high-performance liquid chromatography,HPLC）检测各菌株细菌海藻糖的含量。结果:1.MSMEG＿0372是H37Rv菌株中Rv0242c的直系同源基因,二者的基因同源性为78.9%,蛋白同源性为82.60%。MSMEG＿0372位于M.smegmatis基因组的414922-416274区域。2.成功构建了pMV361-MSMEG＿0372质粒和MSMEG＿0372基因过表达菌株。3.在振荡培养或静置培养条件下,与WT菌株相比,OE菌株的细菌浊度明显增高（P＜0.05）,而KO菌株降低（P＜0.05）,COM菌株的细菌浊度介于WT和OE菌株之间（P＜0.05）。4.与WT菌株相比,OE菌株的菌落变大,菌落表面光滑平坦,KO菌株的菌落变小,表面干燥褶皱,而COM菌株的菌落大小和表面粗糙度介于WT和OE菌株之间;OE菌株菌落的“蜡样裙边（waxy skirt）”较宽,而KO菌株几乎没有,COM菌株菌落的“蜡样裙边”宽度介于WT与OE菌株之间;KO菌株的菌落被刚果红染色较深,OE菌株的菌落被刚果红染色相对浅,而COM菌株的菌落与刚果红结合的能力介于WT和OE菌株之间;OE菌株的菌落滑动性能增加,KO菌株的菌落滑动性能减少,而COM菌株的菌落滑动性能介于WT与OE菌株之间。5.WT菌株的生物膜呈“地图”状,而KO菌株生物膜的团块相对聚集。OE菌株的生物膜呈“绳索”状,而COM菌株生物膜的“绳索”相对稀疏。与WT菌株生物膜相比,KO菌株的生物膜含量增高（P＜0.05）,OE菌株和COM菌株的生物膜含量降低（P＜0.05）,但覆盖面积增加。6.与WT菌株相比,OE菌株细菌的细胞壁表面凸起增多,KO菌株细菌的细胞壁光滑平坦,而COM菌株细菌细胞壁表面的光滑度介于WT与OE菌株之间。与WT菌株相比,KO菌株细菌的脂肪酸和海藻糖含量增高（P＜0.05）,OE菌株降低（P＜0.05）,而COM菌株细菌的脂肪酸和海藻糖含量介于WT与OE菌株之间（P＜0.05）。结论:1.MSMEG＿0372是Rv0242c的直系同源基因,具有保守性。2.MSMEG＿0372有利于分枝杆菌生长,使菌落形态由粗糙变为光滑,滑动性能增加;MSMEG＿0372减少了生物膜的形成和海藻糖水平,改变了细菌的脂质谱。
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