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研究背景肺纤维化（PF）是以肺实质破坏、细胞外基质沉积、成纤维细胞和肺泡上皮细胞表型改变为特征的一系列异质性肺间质疾病的终末期病理改变。本课题组前期研究发现麦门冬汤可通过多种机制干预PF进程,有效缓解PF进展。半夏作为麦门冬汤中的臣药在全方中具有重要地位,且有多项研究证实了半夏的抗PF作用。半夏因产地、炮制工艺不同,药用成分种类及含量亦不同,进而具有不同功效和临床适应症。目前,关于产地、炮制方法等因素对于半夏抗PF疗效的影响尚未见文献报道。因此,深入开展半夏及其炮制品抗PF作用的药效学研究,对于指导其临床安全、合理用药具有重要意义。研究目的探讨不同产地、炮制方法的半夏治疗PF的有效性及安全性,筛选具有最佳抗PF药效的优质种源及炮制工艺的半夏,为临床合理用药提供参考。研究方法1体外实验（1）PF体外模型建立。以含1%血清培养基配制的TGF-β1（10ng/mL）体外诱导MRC-5细胞、HPF细胞48h,天狼猩红染色法测定胶原沉积情况;以含不同浓度血清培养基配制的TGF-β1（10ng/mL）诱导MRC-5细胞与HPF细胞24h后,Western Blot法检测α-SMA蛋白与COL1蛋白表达情况;（2）半夏对正常MRC-5细胞活性的影响。选取不同产地（河北/甘肃）的生半夏、清半夏、法半夏和姜半夏,按照冷凝回流法煎煮1h制成半夏水煎液,分别以不同浓度（相当于生药量2.1g/L、4.2g/L、8.4g/L、16.7g/L）处理正常MRC-5细胞48h后,CCK-8法检测细胞活性,观察不同产地的半夏炮制品对正常MRC-5细胞活性的影响;（3）半夏对TGF-β1诱导的MRC-5细胞的影响。以10ng/mL TGF-β1诱导MRC-5细胞建立PF体外模型,将不同产地（河北/甘肃）生半夏、清半夏、法半夏和姜半夏的水煎液按不同浓度（相当于生药量2.1g/L、4.2g/L、8.4g/L、16.7g/L）分别处理MRC-5细胞48h后,CCK-8法检测各组细胞活性,天狼猩红染色法测定胶原沉积情况;（4）甘肃生半夏抗PF体外验证。以1Ong/mL TGF-β1诱导MRC-5细胞24h后,Western Blot法检测不同浓度甘肃生半夏水煎液（相当于生药量2.1g/L、4.2g/L、8.4g/L）对TGF-β1诱导的MRC-5细胞α-SMA蛋白、COL1蛋白表达的影响。2体内实验（1）建立PF小鼠模型。C57BL/6N小鼠,将小鼠随机分为4组,分别为正常组、2mg/kg BLM组、4mg/kg BLM组、6mg/kg BLM组,每组4只;除正常组外,其余各组采用无创性气管滴注博来霉素（BLM）法建立PF小鼠模型,观察并记录小鼠体重、呼吸状态等一般状态情况,采用HE染色、Masson染色观察肺组织病理形态,Western Blot法检测各组肺组织α-SMA蛋白表达情况;（2）生半夏水煎液抗PF作用药效验证。C57BL/6N小鼠,将小鼠随机分为5组,分别为正常组、模型组、生半夏低剂量组（2.5g/kg）、生半夏中剂量组（5.0g/kg）、生半夏高剂量组（10.0g/kg）,每组5只;除正常组外,其余各组采用无创性气管滴注法给予BLM（2mg/kg）建立PF小鼠模型,于造模后第14天,生半夏的各剂量组分别给予相应剂量的生半夏水煎液灌胃,正常组及模型组给予生理盐水0.3mL/只/次灌胃,早晚各一次,各组给药14天;观察小鼠一般情况,造模后第28天取材,观察肺组织外观形态,测定肺、肝、脾、肾脏器指数;羟脯氨酸含量检测试剂盒测定肺组织羟脯氨酸（HYP）含量;肺组织HE染色、Masson染色观察小鼠肺组织病理形态改变;免疫组织化学染色检测肺组织内α-SMA蛋白、COL1蛋白表达和分布情况;并通过Western Blot检测各组小鼠肺组织内α-SMA蛋白、COL 1蛋白表达情况。结果1体外实验（1）PF体外模型构建。①对于MRC-5细胞,使用含不同浓度血清（无血清、0.1%血清、1%血清）培养基配制的TGF-β1（10ng/mL）诱导MRC-5细胞后,与正常组比较,各模型组胶原含量、α-SMA蛋白和COL1蛋白表达水平均明显增高（p＜0.05）,其中尤以无血清培养基配制的TGF-β1诱导效果最明显（p＜0.05）;②对于HPF细胞,使用含不同浓度血清培养基配制的TGF-β1（10ng/mL）诱导后,与正常组比较,各模型组胶原沉积含量、α-SMA蛋白和COL1蛋白表达水平均明显增高（p＜0.05）,其中尤以无血清培养基与含0.1%浓度血清培养基配制的TGF-β1诱导效果最明显（p＜0.05）,而无血清培养基与含0.1%浓度血清培养基配制的TGF-β1诱导效果之间无显著统计学差异（p＞0.05）。因此,选择以无血清培养基配制的TGF-β1（1Ong/mL）诱导肌成纤维细胞,能够成功建立PF体外模型;（2）半夏干预正常MRC-5细胞。河北半夏:各浓度组的清半夏、姜半夏、法半夏对正常MRC-5细胞活性均具有明显抑制作用（p＜0.05）,生半夏（2.1g/L、4.2g/L、8.4g/L）浓度组对正常MRC-5细胞活性无明显抑制作用,当浓度达到16.7g/L时,生半夏对正常MRC-5细胞活性产生了明显抑制作用（p＜0.05）;甘肃半夏:姜半夏各浓度组对正常MRC-5细胞活性无明显的抑制作用（p＜0.05）;生半夏、清半夏仅16.7g/L浓度组对正常MRC-5细胞活性产生抑制作用（p＜0.05）;法半夏（2.1g/L、4.2g/L、8.4g/L）浓度组对正常MRC-5细胞活性均具有抑制作用（p＜0.05）,当浓度达到16.7g/L时,对正常MRC-5细胞无明显抑制作用（p＞0.05）;（3）半夏干预TGF-β1诱导的MRC-5细胞。不同产地、不同炮制工艺、不同浓度半夏干预正常MRC-5细胞48h。①CCK-8结果表明,河北半夏:与模型组相比,4.2g/L、8.4g/L法半夏,16.7g/L姜半夏,8.4g/L、16.7g/L清半夏和生半夏对TGF-β1诱导的MRC-5细胞活性具有显著抑制作用（p＜0.05）,其他浓度组无明显抑制作用（p＞0.05）;甘肃半夏:与模型组相比,16.7g/L清半夏与8.4g/L、16.7g/L生半夏对TGF-β1诱导的MRC-5细胞活性均具有显著抑制作用（p＜0.05）,各浓度组法半夏与姜半夏均对TGF-β1诱导的MRC-5细胞活性均具无有显著抑制作用（p＞0.05）。②天狼猩红染色结果表明,河北半夏:与模型组相比,8.4g/L、16.7g/L生半夏组能够显著减少胶原沉积（p＜0.05）,其他半夏炮制品的各浓度组未见明显统计学差异（p＞0.05）;甘肃半夏:8.4g/L、16.7g/L生半夏能够显著减少胶原沉积（p＜0.05）,其他半夏炮制品的各浓度组对胶原沉积均未见明显抑制作用（p＞0.05）。③不同产地生半夏药效进一步比较,甘肃生半夏（8.4g/L）对TGF-β1诱导的MRC-5细胞活性及胶原沉积的抑制效果均优于河北半夏（8.4g/L）（p＜0.05）。因此,选择甘肃生半夏作为后续药效学验证的干预药物,用药浓度分别为2.1g/L（低浓度组）、4.2g/L（中浓度组）和8.4g/L（高浓度组）;（4）甘肃生半夏抗PF体外验证。Western Blot分析结果表明,与模型组比较,甘肃生半夏各浓度组（相当于生药量2.1g/L、4.2g/L、8.4g/L）均能够显著抑制TGF-β1诱导的MRC-5细胞、HPF细胞中α-SMA蛋白与COL1蛋白的表达（p＜0.05）,体外实验结果表明,8.4g/L生半夏组抗PF效果最为明显。2体内实验（1）建立PF动物模型。与正常组相比,模型组小鼠出现呼吸困难、体重下降等病理表现;2mg/kg BLM、4mg/kg BLM、6mg/kg BLM 组死亡率分别为 0、25%、75%;HE染色结果显示,模型组小鼠肺组织结构破坏严重,肺泡壁塌陷,实变区肺泡壁增厚,肉眼可见肺间质区存在大量炎性细胞浸润;Masson染色结果显示,模型组肺组织可见大量胶原沉积,且随着BLM剂量的增加,肺组织纤维化表现逐渐加重;Western Blot结果显示,与正常组比较,各模型组小鼠肺组织α-SMA蛋白表达水平明显增加（p＜0.05）。因此,后续选择以无创性气管滴注BLM（2mg/kg）方式建立PF体内模型。（2）甘肃生半夏水煎液抗PF体内药效学验证。模型组PF小鼠出现呼吸困难、毛发粗糙、体重下降、肺组织表面发黑等病理改变;各剂量生半夏组小鼠上述症状均有不同程度缓解,肺组织大体形态明显好转;HE和Masson染色结果显示:与模型组相比,生半夏水煎液各剂量组均能明显减轻BLM诱导的PF小鼠肺间质中炎性细胞浸润,恢复肺泡结构,减少胶原沉积,降低肺组织中的HYP含量（p＜0.05）;Western Blot结果显示,与模型组相比,生半夏水煎液各剂量组均能明显抑制小鼠肺组织中α-SMA蛋白与COL1蛋白表达（p＜0.05）。以上指标中,均以生半夏高剂量组效果最显著。结论1不同产地、不同炮制工艺的半夏制品抗PF作用不同;8.4g/L甘肃生半夏对正常成纤维细胞活性未产生明显抑制作用,但对TGF-β1诱导后的成纤维细胞活性具有显著抑制作用,能阻止成纤维细胞向肌成纤维细胞分化,抑制其胶原合成,甘肃生半夏为抗纤维化药物的最佳选择。2生半夏水煎液对BLM诱导的PF模型小鼠具有明显的抗纤维化作用。