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肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma,HCC,简称肝癌）是目前全世界的恶性肿瘤中最常见的一种,具有早期诊断困难、容易复发、预后差等特点。深入研究肝癌的发生、发展、转移和复发的相关影响因子和作用机理,探索肝癌早期诊断、分子靶向治疗的靶点和预测转移、复发相关的生物标志物因具有临床意义,成为近年来肝癌研究的主要方向之一。近年来,由于高通量测序技术和生物信息学的不断进步与完善,人们对长链非编码RNA（Long non-coding RNA,lncRNA）的研究不断深入。lncRNA在肝癌发生发展中的作用和价值逐渐受到了公众的关注,在肝癌的增殖,凋亡,侵袭和转移过程中都起到了重要的作用,并有望作为肝癌诊断和治疗的分子标记物和潜在的治疗靶标。本课题组前期已通过高通量二代测序技术（Next-generation sequencing,NGS）、生物信息学数据分析,筛选出了与肝癌密切相关的长链非编码RNA:lnc145801,通过对临床肝癌组织标本的研究,验证了其在肝癌组织中高表达,并与复发转移相关。研究目的本课题通过构建lnc145801敲低的肝癌稳转细胞株,研究lnc145801敲低稳转细胞株迁移侵袭能力、增殖及凋亡的情况,检测敲低lnc145801对上皮间质转化（Epithelial-Mesenchymal Transformation,EMT）相关标志物的影响,初步探索lnc145801影响肝癌迁移及侵袭的分子机制,为研究lncRNA在肝癌中的功能及其临床价值提供理论基础。研究方法1.运用实时荧光定量PCR法（real-time quantitative PCR,RT-qPCR）检测8株肝癌细胞株（Hep G2、SMMC7721、Huh7、MHCC97L、Hep3B、MHCC97H、SK-Hep-1、HCCLM3）中lnc145801的表达水平,筛选出后续用于构建lnc145801敲低的肝癌稳定转染细胞株。2.构建sh RNA-lnc145801慢病毒载体及作为对照的空载体,制备慢病毒感染人肝癌细胞株,通过嘌呤霉素筛选程序,构建lnc145801敲低及其空载体的肝癌稳定转染细胞株。3.通过Transwell实验检测细胞迁移、侵袭能力;平板克隆形成实验和免疫组化技术（ki-67）检测细胞增殖情况;Annexin V-PE/7AAD流式细胞术检测细胞凋亡情况,观察lnc145801敲低肝癌稳转细胞株迁移、侵袭能力和增殖、凋亡情况的改变。4.通过qPCR、Western Blot技术检测lnc145801敲低稳转株的EMT相关标志物E-cadherin、β-catenin、N-cadherin、vimentin及转化生长因子1（Transforming growth factor-β1,TGF-β1）在转录水平及翻译水平的改变。5.制作lnc145801敲低及其空载体稳转细胞株的细胞蜡块,通过免疫组化技术检测及软件分析来判断EMT相关标志物β-catenin、N-cadherin、vimentin及TGF-β1的表达差异。研究结果1.qPCR结果显示,lnc145801表达水平从低到高的肝癌细胞株依次是:SMMC7721、HepG2、Huh7、SK-Hep-1、MHCC97L、Hep3B、MHCC97H、HCCLM3。故选用lnc145801表达水平较高的MHCC97H、HCCLM3细胞株进行后续试验。2.成功构建sh RNA-lnc145801慢病毒载体及相应空载体,感染人肝癌细胞株HCCLM3及MHCC97H后,成功构建了4株lnc145801敲低及其空载体的稳转细胞株,分别命名为LM3-sh-lnc145801、LM3-sh-NC和97H-sh-lnc145801、97H-sh-NC。3.检测敲低lnc145801稳转细胞株的生物学功能:与NC组对比,lnc145801敲低稳转株的增殖、迁移和侵袭水平降低,差异具有统计学意义（P<0.05）。Annexin V-PE/7AAD流式细胞术检测细胞凋亡情况发现,敲低lnc145801促进肝癌细胞的凋亡,差异具有统计学意义（P<0.05）。4.qPCR、Western Blot检测lnc145801敲低稳转株的EMT相关标志物,与NC组对比发现,上皮标志物E-cadherin、β-catenin的mRNA及蛋白表达量上升,间质标志物N-cadherin、vimentin的m RNA及蛋白表达量下降,细胞因子TGF-β1的mRNA及蛋白表达量下降。5.免疫组化法检测EMT相关标志物,并进行软件光密度分析,与NC组对比,lnc145801敲低后上皮标志物β-catenin表达增高,间质标志物N-cadherin、vimentin及TGF-β1的表达降低。结论1.成功构建敲低lnc145801稳定转染肝癌细胞株的慢病毒表达载体,为进一步研究lnc145801的功能及机制奠定基础。2.lnc145801敲低稳转株的增殖、迁移和侵袭能力降低,凋亡能力得到提高。3.lnc145801敲低抑制上皮间质转化的相关蛋白,提示lnc145801敲低抑制肝癌细胞侵袭迁移可能与EMT有关,检测lncRNA可为临床判断HCC转移复发提供新思路。