论文部分内容阅读
秸杆资源是我国丰富的能量资源,也是自然界中存在最广泛的一类碳水化合物,同时它也是地球上数量最大的再生资源。由于秸杆的组分不易分解,其利用率很低。秸杆中主要成分是木质纤维素,包括木质素、纤维素和半纤维素。它们只有一小部分得到了利用,绝大多数浪费的同时还造成环境污染。利用微生物生产的纤维素酶将其转化为人类急需的能源物质,对于人类社会解决环境污染、食物短缺和能源危机具有重大的现实意义。
本论文采用能够有效降解木质素和纤维素的菌株白腐真菌和康宁木霉作为出发菌株进行实验,最终有效生产单细胞蛋白。本论文内容主要包括:木质素酶和纤维素酶高产菌株的产酶条件的研究;康宁木霉和白腐真菌发酵培养基的优化研究;康宁木霉和白腐真菌混菌发酵条件的优化研究;康宁木霉和白腐真菌原生质体融合条件的研究;融合子性质性能鉴定;亲本和融合子产酶的分离和纯化研究;酵母和融合子混菌发酵产单细胞蛋白的研究。经过大量实验工作,得到了如下结果:
1)利用正交试验确定康宁木霉和白腐真菌混合发酵的最佳培养基组成:秸秆:麸皮为5:1,硫酸铵1.4%,硫酸镁0.05%,磷酸二氢钾0.05%,硫酸亚铁0.01%,硫酸锰0.01%,硫酸亚铁0.01%,硫酸锰0.01%,氯化钠0.5%,pH6.5。培养温度28-30℃,转数180r/min,接种时间间隔为48h,混合菌的接种量3%,装液量40mL/250mL。在此条件下混合菌的产酶高峰期由5-6d缩短为4-5d,优化后酶活力的平均值FPA为2.53U,CMCase为3.08U,分别比优化以前提高了1.08U和1.44U;PODcase为7.98U,比优化前提高了2.69U。
2)单因素实验探讨康宁木霉和白腐真菌的对数生长中期分别是10-40h和50-100h,在此生长期内以0.7%的氯化纳为渗透压稳定剂,0.1%二硫苏糖醇为脱壁促进剂,以正交实验探讨纤维素酶和蜗牛酶的配比分别为2∶1和1∶1,酶浓度为2%,酶解时间3h,酶解温度为30℃条件下完成两菌株的原生质体制备和再生。
3)从多种真菌抑制剂中试验挑选真菌抑制剂氟康唑作为亲本生长的抗药性标记筛选,白腐真菌在浓度为400μg/mL的条件下抑制生长。康宁木霉的原生质体在硫酸二乙酯与紫外复合处理条件下灭活。
4)采用35%PEG6000作为促融合剂,0.1mmol/LCaCl2参与的条件下,25℃,25min进行融合,获得7株融合子,其中2株稳定传代。
5)采用与亲本的菌落特征对比,生长曲线比较,酶活力比较,蛋白全细胞电泳,同工酶电泳,确定融合子与亲本的遗传相关性和差异性,鉴定融合子的形成。
6)亲本和融合子的发酵粗酶液分别经过硫酸铵盐析,利用SephadexG-100柱两次过柱分离纯化纤维素酶和木质素酶,融合子富含纤维素酶活和过氧化物酶活,亲本白腐真菌含有过氧化物酶活,康宁木霉含有滤纸酶活和羧甲基纤维素酶活。以薄层层析和高效液相色谱对比融合子与亲本发酵产物。
7)对融合子的发酵能力和条件进行了摸索,通过正交试验获得了融合子产酶的最适条件为硫酸铵氮源,pH为5.5,1.0%的麸皮、温度为28℃,适当添加Ca2+0.05%,Mn2+0.05%,Fe2+0.01%,K+0.05%,培养4d产酶量最高。
8)利用正交实验得到了秸杆在融合子作用下酶解糖化并混合酵母发酵生产单细胞,获得最适发酵条件为:培养基成分以秸杆粉为降解对象,温度28℃,含水量20倍,接种量5%,pH6.5,真菌降解秸杆1d后接入酵母。在这个条件下粗蛋白的产量为28%,比发酵前提高18.35%;粗纤维的分解率47.3%。