动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)是一种全身性的、弥漫的慢性发展过程，是导致冠心病的主要病理基础。大量研究发现，炎症和代谢异常与动脉粥样硬化的发生发展密切相关，而其中脂质代谢作为冠心病独立的危险因素在动脉硬化发生过程中起着至关重要的作用。动脉粥样硬化的病理过程大概分为血管内皮功能受损、血管内膜增厚和斑块形成三个阶段。其中以血管平滑肌细胞增殖和脂质沉积为主要特征的血管内膜增厚阶段是动脉硬化形成的主要环节，因此对于这部分的研究一直是热点问题。MicroRNA（miRNA）是一种由非编码区域转录的小片段RNA，广泛的参与细胞的生长、分化、发育等生理病理过程。随着对miRNA认识的不断深入，研究者们发现miRNA在心血管疾病中起到了极其重要的作用，不仅参与心血管疾病的发生过程，其表达变化还与疾病的诊断和预后密切相关。MicroRNA-29a(miR-29a)是新近发现的一个与细胞增殖紧密相关的小分子RNA家族，参与多种疾病，如肝纤维化，肿瘤的发生发展过程等。本实验将探讨miR-29a在动脉粥样硬化的发生、斑块稳定方面的作用及其分子机制。方法：1动脉粥样硬化动物模型的复制及分组本实验动物分为五组，分别为C57BL/6J对照组(B6, n=3)、ApoE敲除小鼠正常饮食组(AD, n=3)、ApoE敲除小鼠高脂饮食组(AG, n=3)、ApoE敲除小鼠尾静脉注射pAd-GFP病毒高脂饮食组(AP, n=3)、以及ApoE敲除小鼠尾静脉注射pAd-miR-29a病毒高脂饮食组(AM, n=3)。C57BL/6J及AD组，正常饮食。AG、AP、AM组，高脂饮食。AP组分别于高脂饮食第1、7、14天尾静脉注射pAd-GFP病毒（1×109pfu）。AM组分别于高脂饮食第1、7、14天尾静脉注射miR-29a病毒（1×109pfu）2miR-29a转染不影响动脉粥样硬化小鼠的血脂水平与B6组和AD组小鼠相比，AG组、AP组和AM组（血脂各项指标比较除HDL以外均有显著性差异，其中TC和LDL-C升高最为显著，6周末升高了3到5倍。但三组间比较差异无统计学意义，以上结果提示，血脂增高在AS斑块形成过程中发挥了重要的作用，但转染miR-29a对血脂水平无影响。3miR-29a对脂质斑块形成的影响高分辨力超声检查:高脂饲养6周末B6组、AD组小鼠主动动脉弓内膜光滑完整，连续，内膜不厚，彩色充盈佳。ApoE敲除小鼠高脂饮食6周后，AG、AP和AM组小鼠主动动脉弓内膜渐粗糙不完整，回声有间断，内膜增厚厚，彩色充盈尚可，可见低回声脂质斑块。4miR-29a转染促进斑块组织中平滑肌细胞的增殖各组小鼠取胸腹主动脉，经HE染色后，光镜下观察发现，B6组和AD组小鼠血管内膜光滑，弹力层完整，中膜未变化；AG组、AP组、AM组均见内膜增厚，有较大斑块形成；AG组和AP组没有明显区别；AM组可见增殖内膜中新增血管平滑肌细胞数量明显增多，提示，miR-29a转染可能通过促进平滑肌细胞的增殖而促进斑块的形成。5miR-29a不影响斑块组织中脂质的沉积油红O染色显示饲喂高脂饲料各组老鼠斑块的泡沫细胞内含有大量聚集的脂肪呈鲜红色。AG组、AP组和AM组均可以看到红染脂质浸润、斑块形成及血栓脱落；三组之间无明显差异。提示，miR-29a转染不影响斑块组织的脂质沉积。6miR-29a促进斑块组织中胶原的合成天狼猩红（胶原）与油红O（脂质）复合染色可见，与B6组及AD组相比，AG组、AP组、AM组胶原合成明显增多，其中以AM组增加最为明显。上述结果提示miR-29a可以促进斑块组织内胶原的合成。7miR-29a不影响斑块组织中巨噬细胞的侵润我们用免疫组化检测巨噬细胞标志物F4/80在各组斑块中的表达与分布，结果发现，在B6组和AD组血管壁中，偶见F4/80阳性的细胞；而AG组、AP组和AM组中，F4/80阳性细胞数及单细胞染色强度均较B6组和AD组明显增高，而且主要分布在中膜层和新生内膜层；AG组、AP组和AM组之间未见显著差别。提示，动脉斑块形成伴随炎性细胞浸润，而过表达miR-29a并不促进巨噬细胞的聚集和侵润。8miR-29a促进斑块组织中平滑肌细胞的增殖免疫组化的方法检测了各组斑块内PCNA的表达，结果显示，B6组和AD组血管壁中偶见PCNA阳性的细胞，AG、AP和AM组PCNA阳性细胞数及单细胞染色强度均较B6组和AD组增高，且主要分布在新生内膜层，其中以AM组PCNA阳性细胞数最多，为对照组的5倍，说明，miR-29a可以促进平滑肌细胞的增殖。9miR-29a促进斑块组织中平滑肌细胞KLF5的表达为了进一步明确miR-29a促进斑块内平滑肌细胞增殖的分子机制，我们用免疫组化和RT-PCR的方法，检测了斑块组织内KLF5表达及其分布，结果发现，KLF5阳性的细胞在AM组较B6和AD组，增加了近5倍。提示，miR-29a促进了斑块内血管平滑肌细胞的增殖的分子机制可能与上调增殖相关转录因子KLF5的表达有关。结果:1动脉粥样硬化动物模型的复制及分组。2miR-29a转染不影响动脉粥样硬化小鼠的血脂水平。3miR-29a对脂质斑块形成的影响。4miR-29a转染促进斑块组织中平滑肌细胞的增殖。5miR-29a不影响斑块组织中脂质的沉积。6miR-29a促进斑块组织中胶原的合成。7miR-29a不影响斑块组织中巨噬细胞的侵润。8miR-29a促进斑块组织中平滑肌细胞的增殖。9miR-29a促进斑块组织中平滑肌细胞KLF5的表达。结论：1miR-29a转染可以促进斑块内平滑肌细胞的增殖。2miR-29a转染不影响斑块组织的脂质沉积和巨噬细胞浸润。3miR-29a可以促进斑块组织内胶原的合成。4miR-29a促进了斑块内血管平滑肌细胞的增殖的分子机制可能与上调。增殖相关转录因子KLF5的表达有关。