【摘 要】
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珍珠颜色是影响珍珠经济价值的一个重要因素,养殖珍珠的颜色取决于提供移植小片的供体贝。本研究以马氏珠母贝金唇贝品系和银唇贝品系为实验材料,首先对贝壳珍珠质中的成色物质进行定性分析,基于重测序数据进行全基因组关联分析(GWAS)获得珍珠质颜色性状关联的SNP位点及候选基因;利用全基因组甲基化测序(WGBS),染色质可及性测序(ATAC-seq)和转录组测序(RNA-seq)技术比较金唇贝和银唇贝外套膜
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珍珠颜色是影响珍珠经济价值的一个重要因素,养殖珍珠的颜色取决于提供移植小片的供体贝。本研究以马氏珠母贝金唇贝品系和银唇贝品系为实验材料,首先对贝壳珍珠质中的成色物质进行定性分析,基于重测序数据进行全基因组关联分析(GWAS)获得珍珠质颜色性状关联的SNP位点及候选基因;利用全基因组甲基化测序(WGBS),染色质可及性测序(ATAC-seq)和转录组测序(RNA-seq)技术比较金唇贝和银唇贝外套膜的差异甲基化区域和差异染色质开放区域,得到关键调控基因,阐释表观遗传对珍珠质颜色的调控作用;对外套膜中外泌体的蛋白质进行鉴定,通过关联多组学数据分析,解析贝壳珍珠质成色的关键因子及途径。具体结果如下:1、贝壳珍珠质成色物质定性分析对金唇贝与银唇贝贝壳珍珠质中金属元素进行分析并比较差异,发现Na、Mg、Ti、Mn、Cu在两组中有显著性差异(P<0.05),且在银唇贝中含量显著高于金唇贝。通过拉曼光谱对珍珠质的有机物进行分析,发现了类胡萝卜素的特征拉曼峰,且在金唇贝中强度显著高于银唇贝,进一步利用HPLC对珍珠质中类胡萝卜素进行定性,跟标准品比对显示为紫黄质。此外,添加食源性类胡萝卜素养殖马氏珠母贝后,实验组外套膜组织的总类胡萝卜素含量显著高于对照组,珍珠层颜色参数表示黄蓝程度的b*值也显著增加。2、全基因组关联分析鉴定珍珠质致色关键因子本研究利用马氏珠母贝重测序数据,基于混合线性模型对贝壳珍珠质颜色性状进行全基因组关联分析,共鉴定到了464个显著关联的SNP位点,解释了4.19%–7.97%的表型变异。这些SNP位点主要位于3、7和14号染色体上。在显著关联的SNP位点上下游100Kb的范围内扫描候选基因,发现标记区间内共对应到441个基因,其中一些基因可能参与贝壳珍珠质颜色的形成过程,包括视黄醇脱氢酶12亚型X1(RDH12)和低密度脂蛋白受体相关蛋白2样(LDLR2)、类胡萝卜素异构加氧酶样(BCOL),含纤连蛋白III型结构域的蛋白2(FN3),几丁质酶3样蛋白1(CHI3L1)。对关联信号集中的14号染色体区域显著关联的SNP位点进行单倍型构建,发现了10个与性状显著相关的单倍块,并在另外的群体中得到验证。3、表观修饰在珍珠质致色的调控机制(1)利用WGBS技术生成了金唇贝和银唇贝的外套膜组织全基因组甲基化谱图,全基因组的平均甲基化水平为基因组胞嘧啶的2.39%,并鉴定了差异甲基化区域和相关基因,根据差异甲基化区域相关基因的注释,筛选了一些可能参与珍珠质颜色形成的相关基因,这些主要编码低密度脂蛋白受体、脂肪酸去饱和酶、视黄醇脱氢酶、类胡萝卜素异构加氧酶,细胞外基质蛋白、P-U1、富含赖氨酸的基质蛋白、富含丝氨酸和甘氨酸的基质蛋白。(2)利用ATAC-seq技术,对外套膜进行了染色质可及性的分析,在银唇贝外套膜套膜区(WMP)vs.金唇贝外套膜套膜区(YMP)比较组,检测到10018个共有染色质可及性区域(ACRs),分别有37452个(WMP)和23817个(YMP)特有ACRs被鉴定到。在金唇贝外套膜中央膜区(YMC)vs.金唇贝外套膜套膜区(YMP),检测到4825个共有ACRs,分别有15430个(YMC)和29010个(YMP)特有ACRs被鉴定到。将差异ACRs进行GO富集和KEGG富集分析发现,脂肪酰辅酶A代谢过程、脂肪酸连接酶活性、金属离子结合、细胞内信号转导,过渡金属离子跨膜转运蛋白活性和脂肪酸合酶活性等GO条目被富集。KEGG富集分析显示脂肪酸伸长率、代谢途径、ABC运输车、ECM-受体相互作用和苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成等通路被富集。(3)结合DNA甲基化、ATAC-seq和转录组数据,推测低密度脂蛋白受体、脂肪酸去饱和酶、视黄醇脱氢酶、类胡萝卜素异构加氧酶,细胞外基质蛋白、P-U1、富含赖氨酸的基质蛋白、富含丝氨酸和甘氨酸的基质蛋白是影响贝壳珍珠质成色差异的候选基因。4、外套膜外泌体蛋白质组学分析利用超速离心法成功分离了外套膜组织中的外泌体,电镜观察其为杯托状结构,粒径在164.6 nm-179.4 nm之间。通过TMT定量测序分析金唇贝和银唇贝外套膜组织外泌体中所含蛋白质丰度,对蛋白质进行注释,发现外泌体中存在Calmodulin、含有EF-hand结构域的蛋白、含纤连蛋白III型结构域蛋白、载脂蛋白、清道夫受体蛋白和β,β-胡萝卜素-15,15’-双加氧酶等差异蛋白,这些蛋白可能参与贝壳珍珠质颜色的形成过程。本论文发现类胡萝卜素和贝壳基质蛋白是影响贝壳珍珠质成色的主要原因,通过SNP突变和表观修饰调控相关基因的转录表达调节色素的沉积,并可能由外套膜分泌的外泌体转运至贝壳珍珠质沉积。为贝壳珍珠质成色的分子机制研究提供新的视角。
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