【背景】阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease,AD）是最常见的神经退行性疾病,降低AD患病率的有效措施是早期发现和早期干预。然而,至今缺乏针对AD早诊早治疗策略。因此,建立AD高危人群队列,并从中发现与认知功能下降相关的外周标志,对AD的早期预测或诊断及其干预有重要意义。2型糖尿病（Type 2 diabetes mellitus,T2DM）和轻度认知损伤（mild cognitive impairment,MCI）是AD的两个独立危险因素。流行病学资料显示,T2DM与认知损伤和迟发性AD密切相关;近年来T2DM的发病率急剧上升、且呈现年轻化趋势;MCI是介于正常老化和AD之间的状态,可为AD的早期干预提供窗口期。本课题组在前期研究中,将T2DM人群分为认知功能正常组（T2DM-n MCI）和MCI组（T2DM-MCI）,并发现这些病人的认知功能损伤与嗅觉障碍、Apo Ee4基因型、血浆Aβ1-42/Aβ1-40比值（r Aβ42/40）和血小板糖原合成酶激酶-3β活性（Total/p S9-GSK-3b,r GSK-3b）升高相关。【目的】基于本课题组建立的T2DM前瞻性队列,通过追踪随访,探索嗅觉功能减退、Apo Ee4基因型、血浆Aβ42/Aβ40水平和血小板GSK-3β活性升高能否用于预测T2DM向MCI或AD转化。【方法】将前期招募的159例T2DM志愿者分为认知功能正常追踪组（n=95）和MCI追踪组（n=64）,分别进行平均19或30个月追踪研究。通过收集患者的基本信息、既往史、服药情况,MMSE得分,嗅觉功能、Apo E基因型、血浆Aβ水平和血小板GSK-3β活性等信息,采用Logistic回归进行多元分析、ROC曲线绘制预测模型。【结果】1.对95例基线水平认知功能正常的T2DM患者的随访研究结果1)在随访过程中进展为MCI者比没有进展为MCI者的嗅觉功能更差、GSK-3β活性更高、Aβ42/Aβ40比值更高:在95例认知功能正常的T2DM病人中,平均30个月的随访期间发现有35例进展为MCI,60例保持正常认知功能。与保持正常认知功能组比,发生MCI人群的基线特征是,嗅觉功能更差（7.46±1.66 vs 6.72±1.25,P=0.015）,血小板GSK-3β活性更高（1.08±1.11 vs 0.62±0.38,P=0.023）、血浆Aβ42/Aβ40比值更高（0.72±0.80 vs 0.39±0.31,P=0.023）;而年龄、性别、高血压、高血脂、冠心病、糖尿病家族史、糖尿病年限、胰岛素治疗、糖化血红蛋白、Apo E基因分型、随访时间和MMSE评分等参数在基线水平无统计学差异。提示嗅觉功能、GSK-3β活性和Aβ42/Aβ40比值升高对预测T2DM患者的认知功能衰退有潜在价值。2)嗅觉障碍、GSK-3β活性和Aβ42/Aβ40比值升高可预测T2DM患者的认知功能损伤:分别对嗅觉得分、r GSK-3b和Aβ42/Aβ40进行ROC曲线和二元回归分析的结果显示,嗅觉得分在T2DM正常认知人群中预测MCI的cut off值为6.25;模型灵敏度为0.771,特异性为0.450,准确率为56.8%,AUC=0.634（95%CI:0.517-0.751）;血小板GSK-3β活性预测MCI的cut off值为1.058,灵敏度为0.486,特异性为0.883,准确率为73.7%,AUC=0.651（95%CI:0.528-0.773）;血浆Aβ42/Aβ40比值预测MCI的cut off值为0.543,灵敏度为0.600,特异性为0.850,准确率为75.8%,AUC=0.664（95%CI:0.539-0.789）。这些结果确认了嗅觉得分、r GSK-3b和Aβ42/Aβ40的改变对T2DM患者认知功能衰退的预测效能。3)血小板GSK-3β活性和血浆Aβ42/Aβ40比值升高是T2DM患者认知功能衰退的独立危险因素:通过校准其他混杂因素后,血小板GSK-3β活性的OR值为4.426（95%CI:1.247-15.708,P=0.021）,血浆Aβ42/Aβ40的OR值为6.188（95%CI:1.255-30.499,P=0.025）。提示二者均是T2DM-n MCI人群进展为MCI的独立危险因素。4)T2DM患者进展为MCI的预测模型:基于上述前瞻性队列的研究结果,以年龄、嗅觉、Apo Ee4、血小板GSK-3β活性和血浆Aβ42/Aβ40为参数,在T2DM人群中建立了MCI的预测模型:logit（MCI）=-4.129-0.007×年龄-0.197×（Apo Eε4=1）+0.352×嗅觉得分+1.150×r GSK-3β（Total/S9）+1.321×r Aβ42/40。模型的AUC为0.751（95%CI:0.640-0.862）,灵敏度0.629,特异性0.833,准确率为75.8%。2.对64例基线水平存在MCI的T2DM患者的随访研究结果经过平均19个月随访,发现T2DM-MCI人群嗅觉功能进一步损伤（7.63±1.72 VS8.09±1.37）,血浆Aβ1-40水平进一步降低（249.61±194.50 VS 202.40±138.25）,而MMSE、血小板GSK-3β活性、血浆Aβ1-42水平在随访期没有发生明显变化。【结论】血小板GSK-3β活性升高和血浆Aβ42/Aβ40比值升高是T2DM患者认知功能衰退的独立危险因素;嗅觉损伤、血小板GSK-3b活性升高和血浆Aβ42/Aβ40比值升高可有效预测T2DM患者向认知功能衰退或AD转化。【背景】阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease,AD）是一种以进行性记忆丧失和认知能力下降,伴有神经元突触变性,脑神经元大量丧失,最终导致人格完全丧失和死亡为特征的神经退行性疾病。目前,该病的原因尚不完全清楚。流行病学研究显示,血浆中的同型半胱氨酸（Homocysteine,Hcy）水平升高,即高同型半胱氨酸血症（Hyperhomocysteinemia,Hhcy）是AD的一个强而独立的危险因素。Hcy是甲硫氨酸前体,是甲基化和反硫化途径中的硫氨基酸中间体。Hcy代谢有三种主要的饮食辅助因子:维生素B6,B12和叶酸。同型半胱氨酸发挥其毒性作用的机制之一就是干扰某些功能蛋白的甲基化,包括磷酸酯酶2A（Protein phosphatase 2A,PP2A）的去甲基化,从而导致Tau蛋白去磷酸化障碍,发生过度磷酸化和聚集。老化也是AD的独立风险因素。在动物体内注射D-半乳糖可诱导其大脑衰老,并且在许多方面与人类大脑衰老相似。D-半乳糖是一种醛己糖,作为一种还原糖,它存在于诸如奶酪、黄油、蜂蜜和樱桃等食物中,亦存在于人体内。在正常浓度下D-半乳糖可转化为葡萄糖,然而在浓度较高时,它与蛋白质和多肽中氨基酸的游离胺发生反应,形成晚期糖化终末产物,引起机体的氧化损伤。本课题组前期研究发现,大鼠尾静脉注射同型半胱氨酸14天可引起Hhcy,同时伴有学习记忆障碍。由于大鼠的成本高、且缺乏相关转基因大鼠作为认证或对照研究,建立小鼠模型势在必行。然而,小鼠尾静脉注射操作难度大。因此,探讨腹腔注射同型半胱氨酸或同时注射D-半乳糖是否也能复制AD样病理和行为异常的小鼠模型,有重要实用价值。【目的】探讨小鼠腹腔注射同型半胱氨酸或与D-半乳糖合并应用能否诱导AD样脑病理改变和认知功能障碍。【方法】腹腔注射不同浓度Hcy对小鼠的影响:将12周龄C57雄性小鼠随机分为四组并在注射前称重:Control组,腹腔注射生理盐水150μl;低浓度Hcy组,根据体重以360μg/kg剂量腹腔注射Hcy溶液150μl;中浓度Hcy组,根据体重以720μg/kg剂量腹腔注射Hcy溶液150μl;高浓度Hcy组,根据体重以1440μg/kg剂量腹腔注射Hcy溶液150μl。连续给药14天后立即进行旷场实验、十字高架实验、水迷宫实验以及条件恐惧实验等行为学实验检测小鼠焦虑和抑郁情绪以及学习记忆功能。随后取小鼠脑组织通过Western blotting实验检测小鼠大脑中不同磷酸化位点的Tau以及通过Dot blotting实验检测小鼠大脑中Aβ含量。同型半胱氨酸与D-半乳糖合用对小鼠的作用:将8周龄C57雄性小鼠随机分成并在注射前称重:Control组,腹腔注射生理盐水300μl;Hcy组,根据体重以剂量为720μg/kg的Hcy溶液150μl及生理盐水150μl连续腹腔注射14天;Hcy+D-半乳糖组,根据体重以剂量为720μg/kg的Hcy溶液150μl以及剂量为120mg/kg的D-半乳糖150μl连续腹腔注射14天;D-半乳糖组,根据体重以剂量为120mg/kg的D-半乳糖150μl及生理盐水150μl连续腹腔注射14天。在连续给药14天后的第1/14/21/28天对小鼠进行旷场实验、新事物识别等行为学实验以检测小鼠焦虑和抑郁情绪以及记忆功能,后期因新事物识别实验对小鼠刺激较小,遂使用Morris水迷宫检测小鼠学习记忆功能。随后每组取3只小鼠使用眼球摘除法取小鼠血液并离心,离心后取血浆于零下80℃冰箱中保存,随后取这些小鼠脑组织通过Western blotting实验检测小鼠大脑中不同磷酸化位点的Tau蛋白以及通过Dot blotting实验检测小鼠大脑中Aβ含量。另取每组3只小鼠灌流取脑后石蜡包埋。【结果】1.在使用低（360μg/kg）、中（720μg/kg）、高（1440μg/kg）浓度同型半胱氨酸通过腹腔注射的方式连续给药14天。在Morris水迷宫实验学习阶段第3-5天高浓度组小鼠的逃避潜伏期延长,而检测阶段低浓度组与高浓度组穿越平台次数都有明显减少。取小鼠海马进行Western blotting检测发现高浓度组小鼠海马中Thr231位点磷酸化的Tau含量升高。同时低浓度组小鼠海马中Aβ含量也有明显上升。2.在合用Hcy和D-半乳糖连续腹腔注射14天停药后的第1天,小鼠海马中Aβ含量升高,并且Hcy组小鼠海马中Ser262位点磷酸化的Tau水平出现升高。在给药结束后第14天,旷场实验显示Hcy+D-半乳糖组小鼠在中央区域滞留时间缩短。在给药结束后第28天,Hcy+D-半乳糖组小鼠海马中Thr231位点磷酸化的Tau含量出现升高。Morris水迷宫实验发现Hcy+D-半乳糖组小鼠在学习阶段的第4,5天逃避潜伏期延长。【结论】腹腔注射高浓度Hcy（1440μg/kg）可引起小鼠学习记忆功能损害,同时在小鼠海马中可见Thr231位点磷酸化的Tau蛋白水平升高。Hcy和D-半乳糖联合注射的小鼠出现焦虑和抑郁样情绪并学习记忆功能的损害,同时伴有海马中Aβ以及Thr231位点磷酸化的Tau蛋白水平升高。腹腔注射高浓度Hcy或与D-半乳糖联合应用可能部分模拟AD样病理和行为的改变。