论文部分内容阅读
目的:在体内外慢性阻塞性肺疾病急性加重期（AECOPD）模型中,改变miR-223水平检测HMGB1、NLRP3、PARP-1及p-p65表达变化,探讨miR-223调控NF-κB/NLRP3/HMGB1炎症环路在AECOPD中的作用及可能分子机制。方法:1.通过给予香烟烟雾提取物（CSE）和脂多糖（LPS）共同刺激小鼠巨噬细胞系RAW264.7和人原代诱导巨噬细胞系THP-1构建体外AECOPD模型。根据本课题组前期研究及相关文献,采用不同浓度CSE（0,5%,10%）和2μg/ml LPS刺激细胞后,用Western Blot检测HMGB1、NLRP3、PARP-1及p-p65蛋白表达变化;然后选取10%CSE和2μg/ml LPS作为干预实验中AECOPD刺激条件。2.从GEO数据库中下载GSE37768、GSE38974和GSE103174数据集,分析正常对照组与COPD组之间肺组织中NLPR3 m RNA的表达情况。3.在体外AECOPD模型中,分别转染miR-223类似物、miR-223抑制物和各自阴性对照miRNA,以及给予NLRP3抑制剂（MCC950）、PARP-1抑制剂（3-AB）后,采用Western Blot检测HMGB1、NLRP3、PARP-1及p-p65蛋白表达变化。4.根据课题组前期经验,采用BALB/c小鼠被动吸烟6个月后构建COPD模型,然后采用气管内微量注射5mg/kg LPS模拟急性加重期,4 h后采用微量注射器分别气管内滴注miR-223对照、miR-223类似物及拮抗剂,24h后处死小鼠,获取肺泡灌洗液和肺组织,采用细胞计数观察各组小鼠肺泡灌洗液中细胞数量的变化,HE染色观察肺泡结构及肺部炎性细胞浸润情况,RT-PCR检测肺泡灌洗液和肺组织中miR-223、HMGB1和IL-1β的m RNA水平变化,ELISA测定HMGB1和IL-1β蛋白水平变化,免疫组织化学染色检测肺组织巨噬细胞中HMGB1、NLRP3和PARP-1的表达和定位,免疫荧光共聚焦实验检测HMGB1在各组肺组织巨噬细胞中的表达和分布变化。结果:一、在体内外AECOPD模型中HMGB1表达增加CCK8结果表明,随着CSE浓度的逐渐增大,细胞的活性和状态没有受到影响。Western blot结果表明,用10%CSE和不同浓度的LPS刺激细胞后,HMGB1蛋白水平随LPS浓度的增大先增加后降低,在10%CSE和4μg/ml LPS的刺激条件下,HMGB1蛋白水平达高峰。免疫组化结果表明,与正常小鼠及COPD小鼠相比,HMGB1在AECOPD小鼠肺泡巨噬细胞内明显增加（细胞浆和细胞核）。二、在体外AECOPD模型和GEO数据库中,NLRP3炎症小体、PARP-1及NF-κB的表达变化Western blot结果表明,HMGB1、NLPR3、PARP-1和p-p65蛋白水平随CSE浓度的增大逐渐增加。在GSE37768、GSE38974和GSE103174数据集中,结果显示,COPD患者肺组织中的NLPR3 m RNA表达高于正常对照组,差异有统计学意义（P＜0.05）。三、在体外AECOPD模型中,采用miR-223类似物或抑制NLRP3和PARP-1,观察NF-κB/NLRP3信号变化对HMGB1的影响在体外AECOPD模型中,转染miR-223类似物后,与对照组相比,HMGB1、NLRP3、PARP-1及p-p65蛋白水平均明显降低。给予MCC950或3-AB,Western Blot结果表明,HMGB1、NLRP3、PARP-1和p-p65蛋白水平均明显降低,且在同时使用MCC950和3-AB后,p-p65和HMGB1蛋白水平进一步降低。四、在体内AECOPD模型中,采用miR-223类似物调控NF-κB/NLRP3/HMGB1炎症环路,观察HMGB1的表达变化及肺部炎症的变化情况肺组织及肺泡灌洗液HE染色结果表明miR-223类似物组小鼠肺部炎症得到显著缓解,炎症细胞浸润明显减少。RT-PCR结果表明,与miR-223对照组小鼠相比,miR-223类似物组小鼠的肺泡灌洗液及肺组织中的miR-223表达升高,HMGB1 m RNA水平降低,并且IL-1βm RNA在肺组织中的表达降低。ELISA结果表明,与miR-223对照组小鼠相比,miR-223类似物组小鼠肺泡灌洗液中HMGB1及IL-1β蛋白表达降低。免疫组织化学染色结果显示,与miR-223对照组小鼠相比,miR-223类似物组小鼠的肺泡巨噬细胞中HMGB1、NLRP3及PARP-1表达减弱,尤以细胞质中HMGB1减弱更为明显。免疫荧光共聚焦实验显示,与COPD组小鼠相比,HMGB1在AECOPD组小鼠肺泡巨噬细胞中表达增加,并可见较多细胞外分泌,而miR-223类似物组小鼠肺泡巨噬细胞胞质中HMGB1表达减弱,细胞外分泌减少。结论:miR-223负调控靶基因NLRP3和PARP-1从而阻断NF-κB/NLRP3/HMGB1炎症环路,有望作为AECOPD有效的治疗方法。