[背景]银屑病（Psoriasis）是一种常见的与遗传、感染、免疫紊乱等多种因素相关的慢性炎症性皮肤病,其在全球患病率约为2-3%。银屑病皮炎典型的临床表现为境界清楚的、散在分布的红色斑块,上覆银白色鳞屑,易反复发作。银屑病典型的组织病理学特征是角质形成细胞（Keratinocytes,KCs）的过度增殖,表皮明显增厚并伴有角化过度或角化不全,由于血管生成因子等促进皮损处微血管的增生,故可见表皮内毛细血管增生扩张,颗粒层明显变薄或消失,棘层增厚,伴随表皮浅层朗格汉斯细胞（Langerhans,LCs）、CD8+T细胞浸润及中性粒细胞聚集;真皮层真皮乳头上延,真皮浅中层可见树突状细胞（dendritic cells,DCs）和多种T细胞如CD4+Th细胞等免疫细胞浸润。银屑病治疗困难且易反复,给患者带来极大的心理和经济负担。GRP78（glucose regulated protein 78）又称热休克蛋白 A5（heat shock protein A5,HSPA5）或免疫球蛋白重链结合蛋白（binding immunoglobulin protein,Bip）,广泛存在于细胞的核内、内质网、胞浆和胞膜上。在应激状态下,过量表达的的GRP78会分泌到胞外,即为分泌型GRP78（sGRP78）。sGRP78具有炎症消退作用,在自身免疫性疾病中如类风湿性关节炎等发挥作用。本课题组前期研究结果也发现sGRP78处理B细胞后能够诱导一群CD19hi B细胞产生,这群细胞高表达PD-L1、FasL并分泌大量的IL-10;sGRP78抑制LPS诱导的炎性细胞因子的产生,如TNF-α等;sGRP78诱导DCs凋亡,下调DCs表面CD80、CD86及MHCII分子的表达等等,而起到抑制炎症的作用。银屑病皮炎的启动和发展依赖经典的IL-23/IL-17正循环,其可以概括为KCs在外界病原刺激或损伤情况下会产生DAMPs和PAMPs,其作用于浆细胞样树突状细胞（Plasmacytoid dendritic cells,pDCs）,pDCs分泌IFN-α/β并诱导DCs分泌大量IL-23,IL-23作用于T细胞诱导其分化为Th17细胞,Th17分泌的IL-17再次作用于KCs,促进银屑病皮炎的发生发展。有研究发现,银屑病患者皮肤GRP78表达下调,尤其在靠近基底层的未分化角质细胞中表达较低。实验室前期研究结果证明sGRP78会诱导DCs凋亡,并下调DCs表面的CD80、CD86及MHCⅡ分子,起到抑制炎症的作用,这提示sGRP78可能通过作用DCs进而影响整个银屑病皮炎的发展。[目的]①检测IMQ诱导的银屑病皮炎皮损中GRP78的表达水平变化;②探索sGRP78能否缓解IMQ诱导的银屑病皮炎;③探索sGRP78缓解IMQ诱导的银屑病皮炎的可能机制。[方法]1.重组小鼠sGRP78的制备将实验室前期保存的pGEX-4T1-GST-sGRP78质粒转入大肠杆菌缺陷株（BL21）,转化后的大肠杆菌经挑选单克隆和表达鉴定后,挑选表达蛋白能力较强的单克隆菌株。LB培养基中摇菌,高速离心机集菌,超声破碎仪破菌,离心取上清获得细菌总蛋白,GST标签蛋白层析柱过滤蛋白,凝血酶切GST标签后,50KD超滤管过滤获得sGRP78蛋白,在超净工作台内将去内毒素后的纯化蛋白经孔径为0.22 μm的滤器物理除菌,再使用生理盐水将去除菌后的sGRP78稀释成浓度为1 mg/ml的溶液,分装后-80℃超低温冰箱保存待用。2.小鼠银屑病模型的建立挑选6-8周C57BL/6雌性小鼠随机分成对照组（Control）、模型组（IMQ）和实验组（IMQ+sGRP78）三组。模型组和实验组每日涂抹咪喹莫特（Imiquimod,IMQ）软膏于背部皮肤,同时实验组每日腹腔注射sGRP78,模型组每日腹腔注射相同剂量生理盐水作为对照。给药前按照银屑病皮损评分标准给每只小鼠进行皮损评分。实验连续5天,第6天终止实验,每只小鼠腹腔注射200 μl 0.5%戊巴比妥钠溶液麻醉以减轻动物痛苦,取小鼠眼球血;颈椎脱臼法处死小鼠后,取对照组、模型组及实验组小鼠的背部造模处皮肤、引流淋巴结及脾脏用于后续实验。3.银屑病皮炎相关免疫细胞和细胞因子的检测流式细胞术检测造模处皮肤、淋巴结及脾脏中树突状细胞、巨噬细胞、单核细胞、中性粒细胞及各类T细胞,流式CBA法结合RT-PCR检测IFN-α/β、IL-23、IL-17、IL-10等相关细胞因子的表达。4.体外实验验证sGRP78对DCs和T细胞的影响取6-8周C57BL/6小鼠,超净台内取出小鼠股骨和胫骨,无菌PBS冲出骨髓细胞,经IL-4与GM-CSF诱导6天后,获得成熟DCs。获取的DCs分为Control组、sGRP78组、IMQ组和IMQ+sGRP78组四组,并分别加入1640培养基、IMQ、sGRP78,6天后收集细胞和培养上清,流式检测细胞表面CD80、CD86、MHCⅡ的表达,流式CBA检测相关细胞因子的表达;sGRP78诱导的DCs与T细胞共孵育72 h后检测T细胞表型。。[结果]1.IMQ诱导的银屑病样皮炎中GRP78表达降低RT-PCR及组织免疫荧光染色检测显示,IMQ处理组小鼠造模处皮肤组织中GRP78表达显著下降,与对照组相比存在明显的统计学差异,提示IMQ处理会使小鼠局部皮肤GRP78的表达水平下降。2.sGRP78输注缓解IMQ诱导的小鼠银屑病皮炎症状IMQ诱导的小鼠银屑病模型组在实验的第三天开始表现出皮肤增厚以及红斑、鳞屑和出血,随着实验的进行,皮损表现不断加重。在IMQ+sGRP78组中,IMQ诱导的小鼠背部皮肤有一定程度的增厚,但与IMQ组相比,其皮肤增厚、红斑、鳞屑和出血程度均较轻。3.sGRP78输注抑制炎症因子分泌及并调节DCs及IL-17+T细胞的数量及比例RT-PCR检测皮损局部细胞因子mRNA的表达,发现与Control组相比,IMQ组皮损组织中多种炎症因子如 IL-17A、IL-17F、IL-17C、IL-22、IL-23、TNF-α、IFN-α及IL-1β表达明显升高,抑炎因子IL-10表达水平明显下降;而与IMQ组相比,IMQ+sGRP78组促炎性细胞因子表达明显下降,IL-10表达水平明显升高。与Control组相比,IMQ诱导的银屑病小鼠造模处皮肤引流淋巴结和外周血中DCs及Th17和γδT17比例及数量增加,但也轻微上调Treg 比例;而sGRP78输注能下调IMQ诱导的小鼠中DCs及Th17和γδT17的比例及数量,明显上调Treg 比例;同时,sGRP78也能下调中性粒细胞比例,干预银屑病样皮损的发生发展。4.sGRP78体外诱导的BMDCs具有抑炎作用分离小鼠骨髓,诱导BMDCs,分为Control组、模型组（IMQ）和实验组（IMQ+sGRP78）,流式检测结果显示IMQ处理的BMDCs表面CD80、CD86、MHCⅡ表达上调,而sGRP78抑制上述分子的表达;RT-PCR检测发现,sGRP78处理亦能抑制IMQ诱导的BMDCs中IL-23、IL-1β的表达;DCs与T细胞共孵育结果显示,IMQ处理的DCs可增加T细胞向Th17细胞分化,而sGRP78处理的DCs抑制T细胞向Th17分化。[结论]通过体内外研究发现,sGRP78能部分缓解IMQ诱导的小鼠银屑病皮炎症状,其潜在机制可能为:①sGRP78下调IMQ诱导小鼠皮损局部IL-17A等促炎性细胞因子表达,上调抑炎细胞因子IL-10表达;②sGRP78下调IMQ诱导小鼠银屑病样皮损模型中DCs的比例;③sGRP78下调IMQ诱导小鼠银屑病样皮损模型中Th17及γδT17细胞的比例,上调Treg细胞比例。综上所述,针对目前关于银屑病发生发展经典的IL-23/IL-17轴,sGRP78通过下调银屑病皮炎中DCs的比例、抑制IL-23、IL-17分泌、控制IL-17+T细胞的数量及比例、上调Treg等综合作用,抑制IMQ诱导的小鼠银屑病皮炎进展。