论文部分内容阅读
红豆杉细胞系在继代培养过程中存在紫杉醇含量不稳定问题，表现为随着继代次数的增加，紫杉醇含量逐渐下降。前期研究发现，这种不稳定现象与红豆杉细胞系在继代过程中甲基化水平升高有密切关系，但作用机制尚不明确。本研究利用蛋白质组技术对去甲基化试剂（5-Aza-CdR）处理前后的红豆杉细胞进行差异蛋白解析，以期揭示DNA甲基化调控紫杉醇合成的机理，获得的主要结果如下：1)建立了HPLC测定红豆杉基因组DNA甲基化水平的方法。最优的方案为：37℃DNA degradase（Zymo Research Corp, Cat. E2017）水解3h；流动相采用：溶剂A为50mmol/L磷酸二氢钾水溶液:三乙胺=100:0.2（pH=5.8），溶剂B为甲醇，梯度设置为10%甲醇，检测波长285nm。此种方法采用酶水解方法实现了仅需3ugDNA就能达到HPLC检测的需求，而且防止了5-甲基胞嘧啶的降解破坏，且此方法具有良好的稳定性和重复性。2)建立了适合红豆杉细胞的蛋白质双向电泳体系。研究表明，采用TCA-丙酮法提取蛋白，pH4-7范围胶条以及改进的IEF聚焦程序，所有样品均获得了清晰的2-DE图谱，可读点都在2000个以上。所建立的实验体系重复性好，为红豆杉细胞蛋白质组学的研究打下了良好的基础。3)通过对去甲基化试剂处理前后的红豆杉细胞总蛋白的2-DE差异蛋白质组学研究，共找到表达差异在1.5倍以上的差异蛋白点121个，质谱鉴定出62个点，其中有33个是新蛋白，功能未知；29个已知功能蛋白，可分为：细胞防御蛋白（Defense/Desease）、碳水化合物代谢蛋白（Carbohydrate Metabolism）、能量代谢蛋白（Energy Metabolism）、脂代谢蛋白（Lipid Metabolism）、次生代谢蛋白（SecondaryMetabolites）、细胞生长和凋亡蛋白（Cell Growth and Death）、转运和分解蛋白（Transport and Catabolism）及其他（Other）未知功能的蛋白。4)克隆了部分差异表达蛋白及紫杉醇合成相关酶，并采用荧光定量RT-PCR技术对表达量进行分析。结果表明：咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶（F14）基因与蛋白的表达趋势完全相同，分析了微管蛋白（A3）、ATP合成酶（C3）、细胞生长相关蛋白（C4）、S-腺苷甲硫氨酸合成酶（D14）、热休克蛋白（E3）、肌动蛋白（M1）6个基因与蛋白的表达量存在差异，推测由于生物体转录后调控，从而导致基因与蛋白水平表达趋势的差异；发现5-Aza-CdR对甲基转移酶基因MET5的影响较大，对MET1、MET4的影响较小，说明5-Aza-CdR对甲基转移酶的影响具有选择性；发现5-Aza-CdR处理后紫杉醇合成过程中的关键酶基因（TS、DBAT、BAPT）的表达量均提高。5)通过对去甲基化试剂处理不同时期红豆杉细胞的蛋白水平及基因水平的综合分析，初步预测了甲基化调控紫杉醇合成的机理。5-Aza-CdR处理红豆杉细胞后能够降低细胞基因组甲基化水平，同时激活了多种途径来参与紫杉醇的合成。①5-Aza-CdR能够激活能量代谢途径、磷酸戊糖途径、脂肪酸代谢途径及其他生物学途径，这些途径能够为紫杉醇的合成提供NADPH、能量、乙酰辅酶A、3-磷酸甘油醛等物质与能量基础。②同时5-Aza-CdR刺激了紫杉醇合成途径中关键酶基因的表达，故紫杉醇含量在甲基化水平降低的同时不断提高。③随着紫杉醇含量的提高及甲基化酶与DNA共价体的进一步合成，对细胞造成伤害，通过信号转导途径，最终引起植物的胁迫反应。随着5-AZa-CdR浓度及活性的降低，其对甲基化的抑制作用降低，故处理后期对甲基化水平的抑制不明显，被激活表达的基因被重新甲基化从而沉默表达，造成紫杉醇含量的降低。