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第一部分神经干细胞的分离培养及鉴定目的:探讨新生S-D鼠大脑皮层组织神经干细胞分离、培养以及鉴定的方法。方法:分离新生S-D鼠(出生1-3d内)的大脑皮层组织,机械吹打后,无血清培养基悬浮培养细胞,获得具有自我增殖能力的细胞克隆,并将细胞克隆贴壁培养测其分化能力。应用抗Nestin、NSE、GFAP免疫组织化学方法鉴定细胞克隆。结果:从新生S-D鼠大脑皮层组织分离的细胞悬液,经悬浮培养,生成大量具有增殖能力的细胞,可形成神经球,抗Nestin。细胞克隆贴壁培养后神经球分化为神经细胞及胶质细胞,抗NSE阳性,抗GFAP阳性。结论:上述方法分离的细胞具有自我更新、自我复制及分化为神经细胞及胶质细胞的能力,属于中枢神经系统干细胞。第二部分新型两亲性肽的设计合成及自组装成凝胶目的:设计合成含IKVAV的两亲性肽,在不同的条件下,探讨其自组装为三维多孔凝胶结构及其力学特性。方法:用固相法合成肽,MS测其分子量, HPLC测其纯度;肽溶于0.1M NaOH溶液中,配10,2,1,0.5wt%肽溶液,各取200ul相应肽溶液,分别加入等体积的DMEM/F12培养液,或置于10M浓盐酸蒸汽中,或涂布于盖玻片上,置于37℃干燥箱。TEM及SEM检测自组装形成的凝胶,用血流计测定凝胶的流变学特性。结果:MS示肽的分子量为1438.31,HPLC示其纯度为96%。肽溶液在DMEM/F12触发下,数秒钟内形成凝胶;于10M HCL蒸气中, 2小时后完全形成薄层凝胶; 37℃的干燥箱中,未见凝胶形成;SEM示10wt%肽形成的凝胶由纳米纤维构成,呈板层状排列,为多孔厚壁的结构。透射电镜显示:2,1,0.5wt%肽自组装凝胶由编织状纳米纤维构成。1wt%肽的凝胶纤维直径有3～5纳米,长度100纳米～1500纳米;2wt%肽的凝胶纳米纤维排列紧密; 0.5wt%肽的凝胶的纳米纤维较细,纤维间空隙较大;时间频率流变学表明:损耗模量呈线性并且比存储模量要小,表明自组装凝胶有一定强度,有足够的强度可支撑细胞接种。结论:本实验合成两亲性肽,在DMEM/F12溶液中可自组装成多孔凝胶,成功构建了“聪明的”含活性配体神经组织工程支架材料。第三部分肽自组装二维凝胶对神经干细胞生长分化的实验研究目的:体外培养出神经干细胞,接种于多肽自组装二维多孔凝胶表面,观察二维凝胶表面其对细胞生长及分化影响。方法:取乳小鼠大脑皮质,机械分离,无血清培养基悬浮法培养出神经细胞,免疫组织化学SABC鉴定。肽溶于NaOH溶液中,PH=9.0,浓度为1wt%,加DMEM/F12在盖玻片上触发多肽自组装为凝胶,透射电镜检测。实验组:神经细胞接种于二维凝胶表面;对照组:神经细胞接种于多聚赖氨酸包被的盖玻片表面;倒置相差显微镜观察细胞生长及分化情况,免疫细胞化学染色,激光共聚焦显微镜观察。结果:免疫组化鉴定:培养的细胞为NSCs,Nestin(+)。透射电镜示:自组装凝胶为交织成网状的纳米纤维。实验组:7天后,倒置相差显微镜观察到神经细胞长出突起,对照组仅有未分化神经干细胞球。激光共聚焦显微镜观察:在实验组,NSCs分化为神经元及星形胶质细胞,NF(+),示强红色荧光,GFAP(+),示弱绿色荧光;对照组:仅有神经干细胞球,Nestin(+),示绿色荧光。结论:本实验首次采用不需胰蛋白酶或EDTA,培养出神经干细胞。透射电镜证实凝胶为多孔的纳米纤维。免疫细胞化学鉴定:二维多孔凝胶对NSCs有良好的细胞相容性,其表面可诱导NSCs分化为神经元及胶质细胞。证明二维自组装凝胶可作为优良的神经组织工程支架材料。第四部分肽自组装凝胶体外三维诱导NSCs的研究目的:合成两亲性肽,在含神经干细胞(NSCs)的DMEM/F12触发下自组装成三维多孔的凝胶,研究其对细胞生长及分化的影响。方法:固相法合成肽。取乳鼠大脑皮质,机械分离,无血清培养,免疫组织化学鉴定。实验组(EG):分A1及A2亚组,1wt%肽加入含细胞的等体积的DMEM/F12液中;对照组(CG):分B1及B2亚组,细胞接种于多聚赖氨酸包被的盖玻片表面,免疫细胞化学染色,LCM及IPCM观察,TEM检测细胞在凝胶中的超微结构。结果:MS示肽的分子量为1438.31,HPLC示其纯度为96%。TEM显示,凝胶为交织排列的纳米纤维。免疫组化鉴定:培养的细胞为NSCs,Nestin(+)。IPCM观察:EG中,NSCs在凝胶内部,2天形成细胞球,7天形成神经元样形态;CG中,B1亚组仅形成细胞球,B2亚组细胞可形成神经元形态。LCM观察,EG中,NSCs分化为神经元与星形胶质细胞,NF(+),GFAP(+);CG:B1亚组可见NSCs球,Nestin(+),B2亚组为神经元与星形胶质细胞,NF(+),GFAP(+);TEM示在凝胶包裹的细胞的胞浆内有丰富的突起。结论:构建两亲性肽,自组装为凝胶,其内部可诱导NSCs发生分化,证明肽基凝胶可作为新型神经组织工程支架材料。