背景和目的牙周病治疗的最终目标是能够消除牙周组织局部的炎症,再生和重建因炎症破坏的牙周组织,即再生和重建具有功能学意义的牙周膜、牙骨质和骨组织。但是由于牙周疾病病因学和口腔微环境的复杂性和特殊性,目前尚无疗效满意的治疗方法。近年来,基于干细胞技术的组织工程学治疗方法为牙周组织再生研究提供了新的思路与方法。种子细胞、支架材料、生长因子是传统组织工程学研究领域主要的研究内容,其中,寻找来源丰富、取材方便、具有增殖分化潜能的种子细胞以及合适的细胞移植载体是目前组织再生医学研究中的热点领域。目前,多种成体干细胞已被应用于牙周再生医学,其中,骨髓基质干细胞(Bone marrow stem cells, BMSCs)和牙周膜干细胞(periodontal ligament stem cells, PDLSCs)被认为是较理想的种子细胞。但BMSCs从骨髓中获得,取材困难,取材过程痛苦,细胞的特性与供者的年龄密切相关,且它的自我更新和分化潜能有限,这些缺点限制了BMSCs的临床应用。PDLSCs是近些年从牙周膜中分离出来的成体干细胞,可以分化为成牙骨质细胞、成骨细胞和牙周韧带细胞,具有很强的分化增殖能力,目前被认为是牙周再生治疗中较理想的种子细胞。但是PDLSCs需要拔除牙齿才能获得,细胞来源少,分离纯化困难。以上这些特点限制了这两种细胞在未来的牙周再生治疗中的广泛应用。牙龈干细胞(GMSCs)是近几年国外学者从牙龈中分离出来的前体细胞,具有间充质干细胞的特性,具有集落生成能力、自我更新能力、多向分化潜能和体内成骨能力,成为干细胞治疗的又一备选细胞。GMSCs还具有取材容易,来源丰富,抗炎和免疫调节等优点。基于以上特点,将GMSCs应用于牙周组织再生,具有可行性和良好的临床推广应用价值。但目前对于GMSCs促进牙周再生的确切作用及其可能存在的机制尚需要大量深入的研究。在组织工程研究中,种子细胞的植入载体和移植途径对于组织再生具有至关重要的作用。细胞膜片技术(Cell sheet, CS)是在组织再生领域中具有广阔应用前景的一项移植策略。由于其保存了细胞间自分泌信号分子和细胞外基质,减少了细胞移植后无效移植细胞的数量,有利于组织的重建或再生,细胞膜片技术在牙周组织工程中的应用也逐渐展开并被证实具有显著促进牙周组织再生的作用。本研究通过体外制备GMSCs和PDLSCs膜片,利用比格犬Ⅲ度根分叉病变模型,探讨并比较GMSCs和PDLSCs修复炎症破坏的牙周组织缺损的能力,为GMSCs在牙周组织工程中的临床应用提供证据。方法1.牙龈间充质干细胞和牙周膜干细胞的分离培养和鉴定1.1GMSCs的分离培养利用酶消化和组织块混合培养法从临床上需行阻生牙拔除、正畸助萌、牙冠延长术的牙周健康患者的牙龈中获得原代细胞,消化传代后,取P2-P4的细胞供后续实验使用。利用有限稀释法,挑取单克隆获得具有干细胞特性的细胞GMSCs进行传代培养。1.2PDLSCs的分离培养利用酶消化和组织块混合培养法从临床阻生拔除的第三磨牙和因正畸需要拔除的健康前磨牙(牙根已发育完成)的牙周膜中获得原代细胞,消化传代后,取P2-P4的细胞供后续实验使用。利用有限稀释法,挑取单克隆获得具有干细胞特性的细胞PDLSCs进行传代培养。1.3干细胞特性及多向分化能力鉴定分别对分离纯化的GMSCs和PDLSCs进行克隆形成率(CFU-F)分析,流式细胞术检测细胞表面分子表达。在体外以0.1μ M地塞米松,10mM β-甘油磷酸钠,50mg/ml维生素C-二磷酸盐分别诱导GMSCs和PDLSCs向成骨细胞分化,茜素红染色法检测钙化结节的形成；以0.1μ M地塞米松,60μ M吲哚美辛,50mg/ml维生素C-二磷酸盐分别诱导以上两种细胞向脂肪细胞分化并用油红0(Oil Red0)染色检测脂肪滴的形成。2. GMSCs和PDLSCs细胞膜片的制备及生物学活性检测将生长增殖状态良好的P4代GMSCs与PDLSCs以1×104细胞/cm2的密度将细胞分别均匀接种培养皿和6孔板中,分为三组诱导培养。1)膜片诱导培养液组：α-MEM+15%FBS,0.1μM地塞米松,10mM β-甘油磷酸钠,100mg/ml维生素C；2)矿化诱导培养液组：α-MEM+15%FBS,0.1μM地塞米松,10mM β-甘油磷酸钠,50mg/ml维生素C；3)普通培养液组：α-MEM+15%FBS;孵育10-12天后观察三组培养条件下细胞成膜能力。获得的GMSCs和PDLSCs细胞膜片行H&E染色进行组织学观察和ALP活性测定。3.牙龈间充质干细胞和牙周膜干细胞膜片对牙周再生作用的体内研究本实验利用包被有eGFP的慢病毒分别转染GMSCs和PDLSCs,经药物筛选后获得稳定表达eGFP的GMSCs和PDLSCs。将这些细胞制备成细胞膜片移植入比格犬牙周炎Ⅲ度根分叉病变模型,8周后处死动物,利用H&E染色、免疫组织化学染色、天狼星红染色及直接荧光显微镜观察,评价GMSCs和PDLSCs对牙周缺损的修复再生能力。结果1.牙龈间充质干细胞和牙周膜干细胞的分离培养和鉴定原代培养3天后,倒置显微镜观察即可见分散的细胞贴壁伸展,当细胞密度达到瓶底的70%-80%时,即可进行传代培养。GMSCs和PDLCs在体外均呈集落样增殖,所形成的克隆形态和大小未见明显差异。克隆形成率分析(CFU-F)结果显示,GMSCs的克隆形成能力略高于PDLSCs。用有限稀释法获得成纤维细胞集落克隆形成单位,将单个克隆扩大培养,获得具有自我更新能力的人GMSCs和PDLSCs。经流式细胞仪检测细胞表面标记发现,该两种细胞均表达CD29、CD105、CD90、 CD73、STRO-1,而不表达CD14、CD45、CD144、CD31以及HLA-DR。GMSCs和PDLSCs经成骨诱导培养基诱导4周后,经茜素红染色后均能观察到大小不一的红染的矿化结节,GMSCs形成的单个矿化结节的面积较PDLSCs的小而分散；GMSCs和PDLSCs向脂肪细胞方向诱导2周后,经油红0染色,可见有红色脂肪小滴形成,两种细胞形成脂滴的形态无明显差别。2.牙龈间充质干细胞和牙周膜干细胞膜片的制备及生物学活性检测GMSCs和PDLSCs分别在三种培养液中诱导培养,从诱导第3天开始倒置显微镜下即可观察到大量沉积的细胞外基质,GMSCs的基质分泌量及分布较PDLSCs更为迅速、均匀。诱导培养10-12天后,收集膜片,添加有100mg/ml维生素C的膜片诱导培养液组可形成完整的细胞膜片,能够完整地自培养皿底剥离,可折叠成需要的形状。添加有50mg/ml维生素C的矿化诱导培养液组形成的细胞膜片易破碎,不能完整的自培养皿底剥离。未添加维生素C的普通培养液组的细胞无法形成膜片。膜片诱导培养液组的细胞膜片H&E染色显示膜片由2-3层细胞组成,细胞间富含大量的细胞外基质。ALP活性检测显示两组细胞经诱导培养后均明显增强,50mg/ml维生素C培养组(即矿化诱导培养液组)略低于100mg/ml维生素C培养组(膜片诱导培养液组),两种细胞在相同培养条件下PDLSCs的ALP表达水平均略高于GMSCs,在矿化诱导液组差异有统计学意义,但在膜片诱导培养组两种细胞的ALP活性差异无统计学意义。3.牙龈间充质干细胞和牙周膜干细胞膜片对牙周再生作用的体内研究含有eGFP的慢病毒转染P3-P4代GMSCs和PDLSCs,转染后48-72h多数细胞均可发出明亮的绿色荧光,感染效率达90%左右。然后对细胞进行药物筛选纯化,获得稳定表达的eGFP的GMSCS和PDLSCs。扩大培养后,于膜片诱导液中诱导培养10-12天收集细胞膜片,折叠后移植入比格犬Ⅲ度根分叉病变模型。8周后处死动物获取下颌骨标本,切片进行H&E染色、免疫组织化学染色、天狼星红染色及直接荧光显微镜观察。组织形态学计量分析结果显示：GMSCs和PDLSCs膜片移植组的新生牙骨质百分比(PRC)和新生骨面积百分比(PRB)显著高于空白对照组,但两种细胞膜片组间差异无统计学意义；免疫组织化学结果显示GMSCs和PDLSCs移植组新生骨中GFP的表达均呈强阳性,而对照组中GFP染色则为阴性。荧光显微镜下观察,大部分新生骨在显微镜下呈明亮的绿色,在新生牙骨质、牙槽骨中的成牙骨质细胞和成骨细胞中均有绿色荧光的表达。偏振光显微镜观察天狼星红染色标本,在GMSCs和PDLSCs膜片植入组再生的胶原纤维多数呈垂直或斜行插入新生牙骨质,为功能性牙周膜,而空白对照组牙周膜纤维束多平行于牙根面,提示该纤维无正常功能。结论1. GMSCs同PDLSCs一样具有自我更新的能力,能够表达干细胞特异性的表面标记,并且具有多向分化的能力。2.添加100mg/ml维生素C的成骨诱导液既能诱导细胞向成骨细胞方向分化,而且能够诱导细胞大量分泌细胞外基质形成细胞膜片,是一种较简单、有效的膜片制备手段。3. GMSCs和PDLSCs膜片表达类似的ALP活性,用于犬Ⅲ度根分叉病变模型有类似的促牙周组织再生效果。4.移植的GMSCs和PDLSCs促进牙周再生的机制包括移植细胞直接分化为牙周再生功能细胞和对宿主细胞的间接调控两种作用。