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脑心肌炎病毒(Encephalomycoarditis, EMCV)属于微RNA病毒科心病毒属,是一种无囊膜的单正股RNA病毒,可以感染昆虫、爬行动物、啮齿类动物和灵长类动物等,可以引起仔猪的致命性心肌炎和母猪的繁殖障碍。目前,我国猪群已有该病毒感染报道,但相关研究还不多。本文采用脑心肌炎病毒重组VP1蛋白,建立成功间接ELISA抗体检测方法,并对EMCV灭活疫苗进行了初步研究。具体内容如下：1脑心肌炎病毒VP1基因的原核表达与蛋白纯化本研究根据EMCV结构蛋白VP1基因序列设计引物,通过RT-PCR方法扩增获得EMCV VP1基因,克隆至原核表达载体pET-32a,构建重组质粒pET-32a-VP1,经酶切和测序鉴定,基因序列全长852bp。重组质粒转化大肠杆菌BL21感受态细胞,经IPTG诱导后能够稳定表达VP1蛋白。通过对诱导菌液浓度、诱导剂浓度及诱导时间的筛选,确定了EMCV VP1蛋白诱导表达的最佳条件,即菌液浓度1.0(OD600)1.0mM IPTG诱导8小时表达效率较高。采用亲和层析方法获得纯化目的蛋白,SDS-PAGE和Western blot结果显示该重组蛋白具有良好反应原性。2脑心肌炎病毒VP1蛋白间接ELISA抗体检测方法的建立和应用本研究采用大肠杆菌表达的EMCV VP1蛋白,建立间接ELISA抗体检测方法。优化的反应条件为：抗原包被浓度为2μg/mL,血清稀释度为1：50,孵育时间1h,酶标SPA稀释度为1：10000,作用时间为30min。判定标准为：P/N值≥2.1,且OD450≧0.40为阳性,OD450≦0.30为阴性,介于二者之间的为可疑。该方法与CSFV、PRRSV、 PCV2、PRV抗体反应均呈阴性,证明其具有良好的特异性。采用该方法对江苏省境内7家规模化猪场的115份血清样品进行检测,结果表明EMCV已经在江苏地区规模化猪场存在,血清抗体阳性率为13.0%。3脑心肌炎病毒间接ELISA抗体检测方法关键试剂保存方法及其稳定性的研究本研究选择不同的抗原保护剂、血清保护剂、洗涤液保护剂分别处理ELISA万法关键试剂,测定其4℃保存时间。结果为：抗原包被的酶标板经含10%硫酸铵的0.01mo/LTris-HCL缓冲液孵育45min,4℃条件下可保存12个月；血清和洗涤液加入终浓度为0.2‰硫柳汞,4℃条件下可保存12个月以上。3批酶标SPA和TMB显色液的稳定性测定结果为：酶标SPA和TMB显色液的批间和批内变异系数均在10%以内。从而为EMCV抗体检测试剂盒的研制奠定了重要基础。4脑心肌炎病毒灭活疫苗制备与免疫效力研究本研究使用终浓度为0.2mM的BEI对EMCV进行灭活处理,分别采用ISA201、 ISA15A, GEL, CP940和1313佐剂配制成5种灭活疫苗。取6周龄Balb/c小鼠随机分为7组,每组5只,第1-6组分别皮下免疫由以上5种佐剂配制的疫苗及未加佐剂的灭活抗原,第7组皮下注射2%DMEM作为阴性对照,间隔3周后进行加强免疫,0.2mL/只。首免后3、6周分别采血测其ELISA抗体水平和中和抗体水平,并分离脾脏细胞进行淋巴细胞转化试验。首免后6周采用EMCV NJ08毒株进行攻毒,腹腔内注射100LD50/只,观察临床症状和病理变化,并检测脑组织中EMCV抗原。结果为：二免后3周各佐剂免疫组小鼠的ELISA抗体水平均达1：1600以上,其中ISA15A、 ISA201、GEL组的ELISA抗体水平均大于1：3200；各佐剂组中和抗体水平相似,平均约1：16；ISA15A、GEL组的淋巴细胞增殖转化刺激指数达3.0以上,略高于其它佐剂组(P>0.05)；攻毒后ISA15A、ISA201和GEL佐剂组保护率均为90%。用ISA15A佐剂配制的灭活疫苗两次免疫5头30日龄EMCV阴性健康仔猪,结果为：该疫接种动物均无异常表现,5头免疫仔猪两次免疫后3周中和抗体水平均在1：128左右,表明EMCV ISA15A佐剂灭活疫苗安全性好,并具有较好免疫效果。