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本论文包括2部分。1胸膜肺炎放线杆菌ApxⅠ与宿主细胞相互作用蛋白的筛选和鉴定猪传染性胸膜肺炎（Porcine Contagious Pleuropneumonia,PCP）是我国最常见和最重要的猪呼吸道传染病之一，猪感染后主要表现为严重的纤维素性肺炎和胸膜炎，造成急性死亡或耐过猪生长缓慢，饲料报酬率低，给我国养猪业造成严重的经济损失。胸膜肺炎放线杆菌（Aactinobaeillus pleuropneumoniae，APP）是其病原，ApxⅠ是该病原菌的最主要致病因子。然而，在蛋白质水平上，对该毒素的作用机理还不清楚，因此，发现宿主细胞中与该毒素相互作用的蛋白，有助于进一步了解其分子致病机理，对预防和控制该病有重要的指导意义，同时为其它革兰氏阴性细菌的毒素研究提供重要的借鉴作用。由于APP-10型只产生ApxⅠ，本实验选用了APP-10型菌，接种于含10mMCaCl2和0.01％NAD的TSB培养基中培养4～5h，离心，取上清，通过硫酸胺沉淀法从APP 10型培养基上清提取天然毒素ApxⅠ，透析3天除去硫酸胺，蔗糖包埋法浓缩毒素，利用Sephadex200按照装柱、PBS平衡、上样和洗脱四个步骤纯化天然毒素。通过紫外分光光度计法测定蛋白质浓度为425μg／ml。将本实验室保存的分泌抗ApxⅠ单克隆抗体的杂交瘤细胞腹腔注入Balb／C鼠，7～10d后采集腹水，利用MAbTrap Kit纯化抗ApxⅠ单克隆抗体。经SDS-PAGE检测，获得较纯单抗。以纯化的抗ApxⅠ单克隆抗体为一抗，以HRP-标记羊抗鼠IgG为二抗，Western blot鉴定天然毒素有良好的活性。用0.1M NaHCO3（pH8.6）将天然毒素稀释为100μg／ml，随后包被ELISA板；利用Ph.D.-12TM噬菌体展示试剂盒按照其说明书，将噬菌体展示肽库与包被天然毒素ApxⅠ的平板共温育，先洗去未结合噬菌体，然后洗脱特异性结合的噬菌体。被洗脱的噬菌体进行扩增，然后再进行下一轮的结合／扩增循环，以富集那些可结合序列。通过4轮的筛选后，洗脱下来的噬菌体感染Ecoli2738，从总量不到100个噬菌斑的平板上挑选18个克隆，以天然ApxⅠ、重组ApxⅠA和ApxⅠCA、BSA包被ELISA板，用ELISA检测18个克隆对靶蛋白的结合，从18个克隆中挑选10个噬菌斑克隆（编号：1～10），提取基因组进行测序。结果显示，其中六个噬菌斑克隆噬菌体基因组序列完全一致，与猪的细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ（COX-Ⅰ）序列的六个氨基酸相同，同源性较高；其余四个克隆的序列各不相同，分别与：（1）人、牛、小鼠、家犬、火烈鸟的钙粘着蛋白，EGF LAG七经G型受体3（cadherin EGF LAG seven-pass G-type receptor 3）；（2）小鼠的类似Rho-GTP酶激活蛋白6（Rho-GTPase-activating protein 6）；（3）小鼠的谷光苷肽-S-转移酶序列等蛋白质的同源性较高；另外一个克隆没有发现和任何已知的哺乳动物蛋白质同源。最后，以羊的细胞色素氧化酶亚基Ⅰ为标准品，通过免疫共沉淀证实两者有一定的作用。本实验结果为进一步开展分子机理研究提供了清晰的思路。2检测猪瘟病毒，猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒和乙型脑炎病毒多重RT-PCR的建立和初步应用猪瘟病毒（CSFV）、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒（PRRSV）和乙型脑炎病毒（JEV）都引起猪繁殖障碍，而且近年来呈现混合感染的特点。准确检测猪繁殖障碍综合症中的病原，采取有针对性的措施，是控制此类疾病的前提。在这些疾病的诊断中，目前主要依靠针对单个病原的RT-PCR或利用单克隆抗体建立的检测抗原方法，如夹心ELISA和胶体金免疫层析法等，这些方法在诊断这三种病原感染中得到了应用，但不能同时检测多种病原感染。由于上述提及的3种病原均为RNA病毒，因此，从含目的病毒的病料中提取RNA，通过特异性引物建立多重RT-PCR，仅需一次反应可诊断CSFV、PRRSV和JEV的单独或混合感染，将对生产实际中该病的防治具有指导意义。本实验根据猪瘟病毒（CSFV）的E2基因保守序列、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒（PRRSV）的ORF7基因及部分ORF6和3-UTR基因序列和猪乙型脑炎病毒（JEV）的E基因保守序列，设计了3对引物，预期扩增目的片段大小分别为288bp、430bp和1015bp。以纯培养病毒抽提RNA，制备cDNA为模板，利用3对引物，通过条件的优化，建立了同时检测这三种病毒的多重RT-PCR。CSFV、PRRSV和JEV的RNA最小检出量分别为0.27ng、0.049ng、0.067ng，其它的RNA病毒如TGEV以及DNA病毒如PPV、PrV、PCV-2检测结果为阴性。以β-actin为对照。利用本方法检测了最近收集174份“猪高热综合症”样品（如血清、肺脏和胎儿），用多重RT-PCR检测结果为：PRRSV阳性的有53份，CSFV阳性的有8份，JEV阳性的有3份，其中混合感染CSFV和PRRSV有3份，PRRSV、CSFV和JEV的阳性率分别为30.4％、4.6％和1.7％；CSFV和PRRSV混合感染阳性率为1.7％。将多重RT-PCR检测临床样品CSFV、JEV和PRRSV阳性PCR产物，进行测序序列，发现CSFV、PRRSV和JEV的PCR产物序列和NCBI数据库中目标基因的同源性分别为92％、90％和89％；这证实了多重PCR的阳性结果为上述三种病毒。结果证明，本实验建立的多重RT-PCR可用于临床检测。