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目的 乳腺癌已成为全球女性最常见的恶性肿瘤，在我国乳腺癌的发病率呈逐年上升趋势。本研究通过观察黄芪及其有效组分对乳腺癌细胞的增殖影响，寻求对三种不同亚型乳腺癌细胞均具有抑制增殖作用的单体化合物；探讨黄芪有效单体抑制细胞增殖可能存在的分子机制，部分阐释“扶正固本”法在防治乳腺癌复发转移中的重要作用；为黄芪抗癌作用提供理论依据。 方法 1.以三种不同亚型乳腺癌细胞Luminal型细胞MCF-7(雌激素ER阳性)、人生长因子受体2(HER2)过表达细胞SK-BR-3及三阴性型MDA-MB-231(ER和PR阴性，HER-2阴性)为研究对象；以MTT比色法观察黄芪水提醇沉剂，黄芪主要组分黄芪总皂苷、黄芪总黄酮及黄芪多糖，黄芪主要单体黄芪甲苷与芒柄花素对乳腺癌细胞增殖的影响。 2.高效液相色谱技术检测不同醇沉浓度黄芪中四种黄酮类物质(芒柄花素及其葡萄糖苷、毛蕊异黄酮及其葡萄糖苷)的含量，分析其与醇沉浓度的关系。 3.MTT比色法观察芒柄花素连续3d对细胞增殖的影响，计算半数抑制剂量；芒柄花素40μM和80μM干预细胞48h，WesternBlot技术检测增殖细胞核抗原(PCNA)蛋白表达情况。 4.以TUNEL法检测细胞凋亡现象，以免疫细胞化学法检测细胞凋亡相关因子BAX、Bcl-2及caspase-3蛋白表达的情况。 5.以流式细胞技术检测细胞周期的改变，并以real-timePCR技术及WesternBlot技术分别检测细胞周期调控因子cyclinD1、cyclinE、p21、p27的基因和蛋白表达改变情况。 6.采用细胞免疫荧光技术观察细胞磷酸化Akt(Ser473、Thr308位点)的表达，以real-timePCR技术检测PIP、PI3K、Akt1、Akt2、PTEN基因表达情况，并以WesternBlot技术分别检测PI3K、PDK1、p-Akt的蛋白表达情况。 结果 1.黄芪对乳腺癌细胞增殖的影响：①黄芪水提醇沉剂：10％醇沉组0.1g/ml，20％醇沉组0.05g/ml及0.1g/ml，30％醇沉、40％醇沉、50％醇沉各三个剂量(0.1g/ml、0.05g/ml及0.025g/ml)，均能够使乳腺癌细胞MCF-7细胞OD值降低，存活细胞减少；各醇沉组三个剂量能够使SK-BR-3细胞OD值降低；10％醇沉0.05g/ml及0.1g/ml，20％醇沉、30％醇沉0.05g/ml及0.1g/ml，40％醇沉、50％醇沉组各三个剂量均能够使MDA-MB-231细胞OD值降低，与空白对照组比较差异具有统计学意义(p<0.05或p<0.01)；并且各组水提醇沉黄芪作用48h，对细胞增殖抑制程度SK-BR-3>MCF-7>MDA-MB-231。②黄芪主要组分：黄芪总黄酮剂量为25μg/ml-400μg/ml之间能够使MCF-7、SK-BR-3及MDA-MB-231细胞OD值降低；黄芪总皂苷用药剂量25μg/ml-400μg/ml时使SK-BR-3细胞OD值降低，与空白对照组比较差异具有统计学意义(p<0.05或p<0.01)；各组有效组分对细胞的抑制率SK-BR-3>MCF-7>MDA-MB-231。③黄芪主要单体：芒柄花素剂量为10μM-160μM使乳腺癌细胞MCF-7、SK-BR-3和MDA-MB-231细胞OD值降低，黄芪甲苷剂量20μM时使SK-BR-3细胞OD值影响与空白对照组比较差异具有统计学意义(p<0.05或p<0.01)；黄芪甲苷剂量达到160μM时对MDA-MB-231细胞OD值影响与空白对照组比较差异具有统计学意义(p<0.05)；各有效单体剂量组对细胞增殖抑制程度SK-BR-3>MCF-7>MDA-MB-231；不同乙醇浓度醇沉提取黄芪中黄酮类化合物芒柄花素的含量，随着乙醇浓度的增高而逐渐增多，呈现出梯度差异。 2.芒柄花素对细胞增殖影响：芒柄花素剂量为10μM-160μM并干预24h时，乳腺癌细胞MCF-7、SK-BR-3和MDA-MB-231细胞存活率逐渐降低，呈浓度依赖关系，与空白对照组比较差异具有统计学意义(p<0.05或p<0.01)；剂量为40μM干预48h时，对三种细胞均能够达到半数抑制。芒柄花素40μM和80μM干预48h时，三种乳腺癌细胞PCNA蛋白相对表达均明显减少，相对降低情况：SK-BR-3低于MCF-7低于MDA-MB-231。 3.芒柄花素对细胞凋亡的影响：芒柄花素40μM和80μM作用48h后，三种乳腺癌细胞经TUNEL染色，均未见明显的TUNEL阳性；免疫细胞化学染色，caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白均未见明显的阳性表达，平均光密度值与对照组比较无统计学差异(p>0.05)。 4.芒柄花素对细胞周期的影响：经流式细胞仪检测，三种乳腺癌细胞G1期比例均明显增多；且随药物浓度的增高G1期细胞比例增加，SK-BR-3>MCF-7>MDA-MB-231；cyclinD1和cyclinE的基因及蛋白表达水平随着药物浓度的增加而降低，P21和P27的基因及蛋白表达水平随药物浓度的增加而升高，与空白对照组比较差异具有统计学意义(p<0.05或p<0.01)。 5.芒柄花素对细胞Akt磷酸化的影响：细胞免疫荧光检测发现p-Akt(Ser473)及p-Akt(Thr308)表达均有所降低；PIP、PI3K、Akt1及Akt2基因表达均有所下降，PTEN基因表达水平升高；WesternBlot技术检测发现PDK1、PI3K、p-Akt(Ser473)及p-Akt(Thr308)蛋白表达均有所下降；芒柄花素剂量为80μM干预48h时，PI3K、p-Akt(Ser473)及p-Akt(Thr308)蛋白降低情况SK-BR-3>MCF-7>MDA-MB-231，PDK1蛋白降低情况MCF-7>MDA-MB-231>SK-BR-3；芒柄花素40μM时，PI3K蛋白降低情况SK-BR-3>MCF-7>MDA-MB-231，p-Akt(Ser473)蛋白降低情况MCF-7>SK-BR-3>MDA-MB-231，p-Akt(Thr308)蛋白降低情况MCF-7>MDA-MB-231>SK-BR-3，PDK1蛋白降低情况MDA-MB-231>MCF-7>SK-BR-3。 结论 1.黄芪水提醇沉剂及其组分黄芪总黄酮、主要单体芒柄花素对三种不同分子亚型乳腺癌细胞均具有抑制增殖作用，抑制率比较SK-BR-3>MCF-7>MDA-MB-231；黄芪水提醇沉剂中芒柄花素含量随醇沉比例增加而增多，但与其抑制乳腺癌细胞增殖效应无明显相关性，芒柄花素可能是黄芪黄酮类化合物中发挥抑制乳腺癌细胞增殖作用的单体之一； 2.芒柄花素能够降低乳腺癌细胞MCF-7、SK-BR-3和MDA-MB-231的存活率，剂量为40μM干预48h时，能够达到半数抑制。并能够降低乳腺癌细胞PCNA蛋白表达，但未观察到明显的诱导凋亡作用，三种乳腺癌细胞作用趋势相似； 3.芒柄花素可使三种亚型乳腺癌细胞G1期细胞比例增加，细胞间比较SK-BR-3>MCF-7>MDA-MB-231；芒柄花素能够调控G1期调控因子基因及蛋白的表达，三种乳腺癌细胞作用趋势相似，表明G1期阻滞可能是芒柄花素导致乳腺癌细胞MCF-7、SK-BR-3、MDA-MB-231细胞增殖抑制的原因； 4.芒柄花素能够调控细胞PIP、PI3K、Akt1、Akt2及PTEN基因表达，调控Akt两个磷酸化位点、PI3K、PDK1蛋白表达，表明Akt的磷酸化与芒柄花素对三种亚型乳腺癌细胞增殖抑制及周期阻滞密切相关，并且p-Akt(Ser473)及p-Akt(Thr308)蛋白表达情况与细胞分子特性密切相关。