研究目的根据我国居民日常饮食中常见的丙烯酰胺(acrylamide，ACR)污染物，利用模式动物斑马鱼对该化学物质是否存在致畸效应进行系统评价，并对其致畸作用的分子基础进行初步研究，为我国孕妇丙烯酰胺发育暴露危险度评价工作的开展，降低因食品丙烯酰胺导致的生育风险提供基础。研究方法(1)采用不同浓度的丙烯酰胺进行斑马鱼胚胎暴露处理，同时分别以维甲酸(Retinoid acid RA)和0.1％二甲基亚砜(DMSO)处理的斑马鱼胚胎作为阳性、阴性对照，通过活体成像技术观测斑马鱼的心率、循环、红细胞数、水肿、出血、脑室膨胀、脑坏死、下颌畸形、尾部形态和运动能力等指标，计算畸形发生指数(teratogenic index，TI)；通过乙酰化的微管蛋白(acetylated tubulin，a-AT)和神经元增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)整体胚胎免疫染色，分别检测ACR暴露后胚胎的运动神经元功能，神经元的增殖状态。(2)通过Affymetrix寡核苷酸微阵列技术筛选ACR暴露后斑马鱼胚胎组织差异表达基因，利用Gene Ontology分析方法对差异表达基因进行功能注释和分类，采用K-means方法分析差异基因的表达模式，通过Pathway方法构建基于信号通路的基因相互作用网络；确定ACR致畸作用的候选靶基因，为进一步研究ACR致畸的分子基础提供依据。(3)通过LNA(locked nucleic acid)修饰的microRNA(miRNA)探针行胚胎整体原位杂交技术，检测斑马鱼胚胎暴露于ACR后神经系统和心肌组织中miRNA的表达水平，初步确定ACR致畸作用的候选靶miRNA；生物信息学分析候选miRNA的靶基因与差异表达基因之间的关系，预测候选miRNA与其靶基因影响斑马鱼发育畸形的重要作用。(4)通过显微注射技术对候选靶miRNA进行过表达(miR-124 duplex)和敲低(2‘甲氧基修饰的反义miR-124)的实验，观测斑马鱼的发育畸形效应，以及运动神经元功能和神经元的增殖状态，生物信息学分析筛选出对胚胎发育畸形有重要意义的miR-124靶基因，初步对候选靶miRNA进行功能鉴定。结果(1)25-50mmol／LACR暴露处理的胚胎很快死亡，15mmol／LACR组表现出多系统的发育畸形，包括体短弯曲、心脏不发育或明显减小等，5-10 mmol／LACR组主要表现为头面部减小，胸鳍发育迟滞，尾部脊髓弯曲，体节减少；在ACR暴露的胚胎于24小时(hours post fertilization，hpf)观察发现，与对照组无差异，而在48hpf和96hpf则出现明显的畸形；计算斑马鱼胚胎的死亡率和畸形率，结果发现在受精后48hpf和96hpf，ACR暴露的斑马鱼胚胎TI值均大于1，分别为4.4和3.6，而RA暴露的胚胎TI值分别为11.3和8.5；a-AT和PCNA整体胚胎免疫染色显示：ACR处理组a-AT表达与正常组无差别，PCNA较正常组高表达且随着剂量的增加而表达增加。RA处理组a-AT表达降低且定位改变，PCNA表达与对照组差别不明显。(2)通过Affymetrix寡核苷酸微阵列分析ACR暴露的斑马鱼胚胎的基因表达情况，结果显示上调基因77个，下调基因80个；通过Gene Ontology分析显示，上调基因的功能主要是细胞的分化和组织化等方面，而下调基因的功能则主要是细胞增生和器官发育等；经GCOS数据处理软件进行统计学分析和数据注释，筛选出一批对斑马鱼胚胎发育畸形有重大影响的侯选靶基因，包括mbtps、nkx2.5、tbx16、zar1、ttn、dcl、hsp70、ache、itgb4、glra4a、bcor和nol5a等；K-means聚类分析和GO富集分析发现具有相同表达模式的基因具有相同或类似的功能，变化程度显著的基因其功能主要是组织器官发育和细胞通讯等，通过Pathway分析发现，ACR暴露诱导的差异表达基因参与Wnt、Notch和Tgf-β信号通路。(3)利用LNA修饰的miRNA探针行胚胎整体原位杂交显示，当斑马鱼胚胎神经系统和软骨骨骼组织暴露于10mmol／L ACR中，可诱导miR-124、miR-125b、miR-9、miR-21、miR-140、miR-206不同程度的表达增加，而心肌组织中miR-1、miR-133a则表达降低；RA暴露的阳性对照组则出现miR-1、miR-133a、miR-21、miR-124的表达增高，以及miR-140和miR-206表达的降低；经生物信息学预测的miR-140靶基因中，lmnb2、LOC554905、nr2f11、rnf11、siah1、zgc:92014、zgc:92331、mbtps2和fgf20在ACR暴露处理的斑马鱼胚胎均出现表达下调，而miR-124的靶基因fn1表达上调、zorba、tcf2和zic2a下调。(4)通过显微注射对候选靶miR-124行过表达，发现在24hpf斑马鱼出现体短、尾卷曲以及头部分化异常等畸形，而敲低miR-124则无明显异常；生物信息学分析显示，合合子期到口咽期miR-124的侯选靶基因在脊髓的表达的包括atp1b3a、fn1、atp6v1ba、jag2、zgc：85956、zic1和zic2a，在后脑表达的包括atp1b3a、atp6v1ba、jag2、mid1ip1和otx2等。结论(1) ACR对斑马鱼胚胎发育具有致畸作用和剂量依赖效应，其中斑马鱼胚胎在高剂量暴露时主要表现为胚胎死亡，而低剂量暴露时则主要表现为胚胎发育畸形；ACR低剂量暴露主要影响胚胎发育后期的神经系统形态发生与分化，由此推测，ACR在体内的代谢残留物可能通过抑制细胞周期影响神经细胞的增殖分化。(2)在ACR致畸作用机制的研究中，一方面可以通过干扰Wnt、Notch和Tgf-β信号通路影响胚胎靶器官的发育；另一方面可以通过干扰发育重要基因的表达调控，如mbtps、nkx2.5和tbx16等，进而影响随后的胚胎靶器官的发育。(3)神经系统miRNA表达增加是ACR诱发斑马鱼胚胎畸形过程中的一个重要分子事件，而miRNA与其靶基因之间的相互作用可能是ACR致畸的一种分子机制。(4)miR-124过表达产生的斑马鱼胚胎腹侧脊髓分化异常以及后脑分化异常，可能与Wnt和Notch信号通路有关。