【摘 要】
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乳酸菌是被美国食品药品管理局FDA（Food and Drug Administration）认证的食品级微生物,其代谢产物乳酸菌细菌素是由核糖体合成的具有抗菌作用的多肽或蛋白质,具有安全、高效、无污染、无抗药性等优点,在食品及医药领域具有很大的应用潜力。细菌素Plantaricin JK（PlnJK）是Class Ⅱb类乳酸菌细菌素,由两条寡肽Plantaricin J（PlnJ）和 Plant
【基金项目】
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国家自然科学基金项目（No.31601449）； 国家重点研发计划（2016YFD0400405）；
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乳酸菌是被美国食品药品管理局FDA（Food and Drug Administration）认证的食品级微生物,其代谢产物乳酸菌细菌素是由核糖体合成的具有抗菌作用的多肽或蛋白质,具有安全、高效、无污染、无抗药性等优点,在食品及医药领域具有很大的应用潜力。细菌素Plantaricin JK（PlnJK）是Class Ⅱb类乳酸菌细菌素,由两条寡肽Plantaricin J（PlnJ）和 Plantaricin K（PlnK）组成,两条寡肽具有明显的协同作用。本研究采用固相合成法合成细菌素PlnJ和PlnK,研究其抑菌谱,探索PlnJK（PlnJ和PlnK等摩尔混合）对敏感菌的作用机制,寻找PlnJK可能的特异性作用靶点。具体内容如下:1.Plantaricin JK抑菌谱和最小抑菌浓度（MIC）的测定。采用固相合成法合成细菌素PlnJ和PlnK两条寡肽,检测抑菌活性结果发现PlnJK不仅能够抑制多种革兰氏阳性菌包括近源性的植物乳杆菌、干酪乳杆菌、发酵乳杆菌、魏斯氏菌,还对致病菌包括藤黄微球菌、枯草芽孢杆菌、白假丝酵母菌及部分葡萄球菌属也有很好的抑制作用,其中最为敏感的植物乳杆菌ZFM811最小抑菌浓度（MIC）为400 nM。对藤黄微球菌最小抑菌浓度（MIC）为22μM。2.pH、温度及酶对Plantaricin JK稳定性的影响。在对pH的耐受性研究中发现细菌素PlnJK在酸性条件下抑菌效果较碱性条件好,在pH为12时抑菌活性下降明显,但残留活性仍有83.03%;在60-100℃条件下处理30min,细菌素PlnJK依旧保持较高活性,说明细菌素PlnJK的温度耐受性较好;细菌素PlnJK对蛋白酶K、木瓜蛋白酶、α-胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶和胰蛋白酶非常敏感,在处理30 min后其活性几乎完全丧失,而对溶菌酶、RNase不敏感。3.Plantaricin JK对敏感菌的作用模式研究。以植物乳杆菌ZFM811及藤黄微球菌GIM1.226为指示菌,对细菌素PlnJK的膜损伤模式做了初步研究。实验发现经过PlnJK处理的细胞,其跨膜电势差和细胞质子浓度梯度迅速耗散,胞内ATP合成受到抑制且对藤黄微球菌GIM1.226较植物乳杆菌ZFM811迅速,其它两方面较植物乳杆菌ZFM811不明显。对经PlnJK处理后的植物乳杆菌ZFM811及藤黄微球菌GIM1.226进行扫描电镜与透射电镜的观察发现,细胞的表面及剖面结构及形态发生了明显改变,说明PlnJK可以使敏感菌细胞膜发生破损,内容物外泄,最终导致细胞死亡。4.Plantaricin JK与Lipid Ⅱ的结合作用研究。通过抑菌圈实验和荧光泄露实验分析PlnJK与Lipid Ⅱ的结合作用,发现Lipid Ⅱ并没有对PlnJK的抑菌活性造成影响,与阳性对照Nisin的实验结果不同,表明常见的细菌素作用靶点Lipid Ⅱ并不是细菌素PlnJK的特异性作用靶点。5.GST pull-down实验寻找Plantaricin JK的特异性作用靶点。提取了植物乳杆菌ZFM811和藤黄微球菌GIM1.226的细胞膜,通过抑菌圈实验分析PlnJK与细胞膜的结合作用,发现PlnJK与细胞膜发生了相互作用。为探究细胞膜蛋白中是否存在细菌素PlnJK的作用靶点,利用GST pull-down技术原理将寡肽PlnJ和PlnK的DNA序列克隆至表达载体pGEX-6P-1中,与GST基因融合,成功构建了重组质粒 pGEX-6P-1-plnJ 和 pGEX-6P-1-plnK,将其转入受体菌E.coli Rosetta-gami 2（DE3）pLysS中,实现了可溶性融合蛋白GST-PlnJ和GST-PlnK的表达。将融合蛋白GST-PlnJ和GST-PlnK固定在谷胱甘肽-琼脂糖树脂上,充当诱饵蛋白来捕获膜蛋白中可能存在的作用靶点,利用iTRAQ技术进行分析,成功捕获到4个具有跨膜螺旋属于植物乳杆菌细胞膜蛋白和1个属于藤黄微球菌细胞膜蛋白可能与细菌素PlnJ结合;3个具有跨膜螺旋的属于植物乳杆菌细胞膜蛋白及2个属于藤黄微球菌细胞膜蛋白可能与细菌素PlnK结合;此外,GST-PlnJ与GST-PlnK融合蛋白pull-down共有产物属于藤黄微球菌细胞膜蛋白的有2个。最后对具有跨膜螺旋的蛋白质进一步进行跨膜结构域检测分析,发现分别有一个具有跨膜结构域的植物乳杆菌和藤黄微球菌细胞膜蛋白可能与细菌素PlnJ和PlnK有特异性结合。
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