目的:探讨针刺对缺血性中风后抑郁(post stroke depression,以下简称PSD)模型大鼠行为学和神经功能缺损程度的影响,探讨针刺对缺血性PSD大鼠脑部病理变化的影响,评价针刺改善缺血性PSD缺血缺氧脑损伤引起的肢体运动障碍和认知情志异常的情况;从“神经炎症反应”学说入手,探讨神经元炎性坏死参与缺血性PSD发生发展过程,探讨针刺对缺血性PSD大鼠神经元自噬水平的影响,阐明针刺调控缺血性PSD大鼠神经元自噬抑制神经元炎性坏死的作用机制和通路。从“自噬降解可能减缓神经炎症反应”理论揭示针刺改善缺血性PSD大鼠肢体功能障碍和抑郁症状的作用机理。方法:应用大脑中动脉线栓阻塞手术(middle cerebral artery occlusion,MCAO)建立暂时性右侧大脑中动脉栓塞再灌注模型(temporary middle cerebral artery occlusion/reperfusion,tMCAO/R),手术后第四天,加用孤养法联合慢性不可预见温和应激法(chronic unpredictable mild stress,CUMS),每天给予两种刺激(共十种刺激,根据随机数字表每天安排两种刺激),连续21天,建立缺血性中风后抑郁(post stroke depression,PSD)模型。给予缺血性PSD大鼠针刺(神庭穴、双侧本神穴)和药物(盐酸帕罗西汀片,按10mg/kg的剂量灌胃给药)干预,每天干预一次,连续干预14天,干预过程中持续给予CUMS刺激,分别在MCAO造模前、CUMS造模后、针刺干预第7天和针刺干预第14天检测。本实验分为四个部分:(1)评价针刺对缺血性PSD大鼠行为学(旷场实验、理毛次数和蔗糖偏好率)和神经功能缺损程度的影响;(2)应用TUNEL检测和TTC检测技术,观察针刺对缺血性PSD大鼠缺血缺氧脑损伤和脑区神经元(海马神经元和皮质前额叶神经元)凋亡情况的影响;(3)应用Western Blot技术观察针刺对缺血性PSD大鼠脑区神经元(海马神经元和皮质前额叶神经元)中自噬相关蛋白表达(Beclin-1、LC3Ⅱ/Ⅰ、p62、Bcl-2)的影响,免疫荧光技术观察针刺对缺血性PSD大鼠海马组织LC3阳性表达量的影响,透射电镜技术观察缺血性PSD大鼠海马和皮质前额叶神经元的超微结构和自噬小体的形态变化,应用HE染色观察针刺缺血性PSD大鼠脑组织病理形态的影响,初步探讨针刺调节缺血性PSD大鼠神经元自噬水平改善神经功能缺损和情感障碍的机制;(4)应用Western Blot技术观察针刺对缺血性PSD大鼠脑区神经元(海马神经元和皮质前额叶神经元)中炎症反应相关蛋白表达(NF-κB、NLRP3、IL-1β、IL-18)的影响,免疫荧光技术观察针刺对缺血性PSD大鼠海马组织NLRP3炎性复合小体各成分(NLRP3、ASC、Caspase-1)阳性表达量的影响,透射电镜技术观察缺血性PSD大鼠海马和皮质前额叶神经元的炎性小体和自噬小体超微结构和形态变化,评价自噬与神经元炎性坏死在针刺改善缺血缺氧脑损伤引起的神经功能缺损和抑郁症状中的作用关系,阐明针刺调控自噬抑制缺血性PSD大鼠神经元炎性坏死的机制研究。结果:(1)第一部分实验研究应用神经功能缺损评分实验评价MCAO线栓法制备缺血性中风脑损伤模型成功,应用旷场实验、理毛次数和蔗糖偏好实验评价孤养联合CUMS刺激法制备缺血性中风后抑郁模型成功。根据旷场实验、理毛次数(又称修饰运动)和蔗糖偏好实验结果,我们发现与正常组比较,缺血性PSD模型组大鼠水平活动次数、垂直活动次数、理毛次数和蔗糖偏好率明显降低(P<0.001),提示造模后的大鼠出现明显的抑郁行为和症状,而针刺组PSD大鼠的水平活动次数、垂直活动次数、理毛次数和蔗糖偏好率较模型组大鼠升高(P<0.001),我们认为针刺可明显改善缺血性中风后抑郁出现的快感(兴趣)缺失、行动能力下降的症状。帕罗西汀组的大鼠活动减少和兴趣降低的症状也得以缓解。与正常组大鼠相比,假手术组的神经功能缺损程度评分无明显变化,差异无统计学意义(P>0.05),缺血性PSD模型组大鼠神经功能缺损程度评分显著升高,差异有统计学意义(P<0.001),提示假手术并不能代替MCAO缺血再灌注手术引起大鼠的神经功能损伤,缺血性PSD模型大鼠神经功能明显受损,表现出一定程度的肢体运动障碍,如行走向左偏或向左打圈、左前肢挛急不能伸展的左侧肢体偏瘫症状,右侧眼睑明显下垂;与PSD模型组大鼠相比,假针刺组神经功能缺损程度评分无明显变化,差异无统计学意义(P>0.05),针刺组大鼠神经功能缺损程度评分显著降低,差异有统计学意义(P<0.001),帕罗西汀药物组的大鼠神经功能缺损程度评分降低,差异有统计学意义(P<0.05),说明针刺可以有效改善缺血性PSD大鼠的神经功能缺损,但帕罗西汀对于缺血性PSD大鼠的神经功能障碍效果不太满意。(2)第二部分实验研究发现,与假手术组大鼠相比,MCAO组大鼠的脑部缺血面积明显增加,差异有统计学意义(P<0.01),缺血性PSD模型组大鼠脑部缺血面积显著增加,差异有统计学意义(P<0.01),说明该实验暂时性右侧大脑中动脉缺血再灌注模型制备成功,而缺血性PSD模型大鼠缺血面积更严重,可能与中风后的情感障碍和中风病之间存在相互作用有关;与PSD模型组大鼠相比,假针刺组脑部缺血面积无明显变化,差异无统计学意义(P>0.05),针刺组脑部缺血面积明显降低,差异有统计学意义(P<0.05),帕罗西汀药物组的大鼠脑部缺血面积减少,但差异无统计学意义(P>0.05),说明针刺能有效减少缺血性PSD大鼠脑部缺血面积,减轻大脑梗死程度,有利于神经功能的修复,而帕罗西汀药物对于缺血性脑损伤程度的改善并无显著作用。MCAO模型组和缺血性PSD模型组大鼠海马神经元和皮质神经元出现明显的神经元凋亡(P<0.001);针刺组PSD大鼠海马神经元和皮质神经元凋亡数量和现象明显减少(P<0.001),说明针刺改善缺血性PSD神经功能缺损和情感障碍的机制可能与抑制神经元凋亡有关,帕罗西汀亦能有效降低缺血性PSD大鼠海马神经元和皮质神经元细胞凋亡情况(p<0.001),帕罗西汀是针对情志障碍的药物,在某种程度上可改善缺血性PSD机体的抑郁症状,抑制神经元凋亡是其抗抑郁的可能机制之一。(3)第三部分实验研究,我们观察了在四个时间点包括MCAO造模前、CUMS造模后(干预前)、干预第7天和干预第14天,各组缺血性PSD大鼠的运动功能、活动兴趣、抑郁症状和神经功能缺损评分的变化。我们发现,针刺和帕罗西汀能有效改善缺血性PSD大鼠对新事物的新奇心理、适应能力和抑郁症状,针刺还能改善缺血缺氧脑损伤,修复缺损神经功能,促进缺血性PSD大鼠肢体活动能力的康复,而帕罗西汀在改善缺血内环境和修复神经功能方面并没有表现出优势,3-MA组缺血性PSD大鼠的运动功能、活动兴趣、抑郁症状和神经功能缺损评分较模型组明显变差,与3-MA组比较,针刺+3-MA组大鼠的神经功能缺损程度和抑郁症状明显减轻,提示针刺可能对缺血性PSD大鼠神经元自噬有调节作用,且可能是通过促进自噬流,从而改善缺血缺氧脑损伤引起的神经功能缺损和认知情感障碍。我们发现,缺血性PSD发生后,大鼠海马区组织中的Beclin-1、BNIP3、LC3Ⅱ/Ⅰ表达明显升高(P<0.001,P<0.001,P<0.01),Bcl-2 表达下降(P<0.001),前额叶皮质组织中的 Beclin-1、BNIP3、LC3Ⅱ/Ⅰ 明显升高(P<0.001,P<0.001,P<0.05),Bcl-2 表达下降(P<0.001),免疫荧光技术观察缺血性PSD大鼠海马区LC3阳性表达升高,透射电镜下观察到模型组神经元形态不规则,有一处出现内陷,核周间隙增宽,线粒体肿胀,自噬小体散在。针刺则显著提高大鼠海马区和前额叶皮质组织中的Beclin-1、BNIP3、LC3Ⅱ/Ⅰ、Bcl-2表达明显升高(P<0.001,P<0.001,P<0.001,P<0.001),大鼠海马区LC3阳性表达升高,改善神经元超微结构和氧化应激损伤。帕罗西汀组大鼠海马区的Beclin-1、BNIP3、LC3Ⅱ/Ⅰ、Bc1-2表达升高(P<0.01,P<0.001,P<0.05,P<0.001),前额叶皮质的Beclin-1、BNIP3、LC3Ⅱ/ⅠBcl-2 表达升高(P<0.001,P<0.001,P<0.05,P<0.001),大鼠海马区LC3阳性表达升高,神经元核膜欠光滑,细胞器较少。假针刺组海马区和前额叶皮质的 Beclin-1、BNIP3、LC3Ⅱ/Ⅰ、Bcl-2 表达无变化(P>0.05,P>0.05,P>0.05,P>0.05)。3-MA组大鼠海马区和前额叶皮质的Beclin-1、BNIP3、LC3Ⅱ/Ⅰ、Bcl-2表达明显降低(P<0.001,P<0.001,P<0.001,P<0.001),大鼠海马区LC3阳性表达减少,神经元自噬水平明显被抑制,且伴随着神经元变性、线粒体肿胀、粗面内质网扩张以及清晰可见的“碎片状”的细胞炎性小体散落在肿胀的线粒体周围,在缺血性PSD机体中神经元自噬和凋亡可能呈现负相关;与3-MA组相比,针刺+3-MA组大鼠海马区和前额叶皮质的 Beclin-1、BNIP3、LC3Ⅱ/Ⅰ、Bcl-2 表达显著升高(P<0.001,P<0.001,P<0.001,P<0.001),大鼠海马区LC3阳性表达增强,神经元缺血缺氧病理状态得到明显改善,自噬小体和细胞器明显增多,未见明显炎性小体,缺血缺氧引起的粗面内质网扩张现象得到明显缓解,神经元形态趋向良好。HE染色结果与上述结果一致。(4)第四部分实验研究,假手术组大鼠前额叶神经元形态良好,细胞器丰富。与假手术组相比,缺血性PSD模型组海马区(P<0.001,P<0.001,P<0.001,P<0.001),和前额叶皮质的 NF-》κB、NLRP3、IL-1β、IL-18 表达升高(P<0.001,P<0.001,P<0.01,P<0.001),免疫荧光结果示缺血性PSD大鼠右侧脑部海马区NLRP3、ASC-1、Caspase-1阳性表达显著增强,海马和皮质神经元形态变差,粗面内质网扩张,自噬小体数量增多,线粒体肿胀,高尔基体空泡化,提示缺血性中风后抑郁脑损伤可引起炎症水平的升高,证明了 PSD机体缺血脑损伤后引起的自噬激活在不及时干预的情况下,启动了凋亡程序转向细胞炎性坏死的过程;与PSD模型组比较,针刺组的大鼠右侧脑部海马区和前额叶皮质的NF-κB、NLRP3、IL-1β、IL-18表达显著下降(P<0.01,P<0.001,P<0.001,P<0.001),神经元核膜光滑,细胞器丰富,自噬小体明显增多,提示针刺能显著改善缺血性PSD机体脑部海马神经元炎症反应。帕罗西汀组大鼠海马区的NF-1κB、NLRP3、IL-1β、IL-18 表达升高(P<0.01,P<0.001,P<0.001,P<0.001),前额叶皮质的 NF-κκB、NLRP3、IL-]β、IL-18 表达均显著降低(P<0.01,P<0.05,P<0.05,P<0.001),神经元核膜明显弯曲,自噬小体偶见,细胞器较少,核膜欠光滑,免疫荧光结果示针刺组、帕罗西汀组右侧脑部海马区NLRP3、ASC-1、Caspase-1阳性表达减弱。说明帕罗西汀改善PSD机体情感障碍抗抑郁的机制可能与改善受损神经元炎症反应相关,但对于神经元超微结构的改善无显著作用。与缺血性PSD模型组相比,假针刺组海马区和前额叶皮质的NF-κB、NLRP3、IL-1β、IL-18表达无变化(P>0.05,P>0.05,P>0.05,P>0.05),假针刺组NLRP3、ASC-1、Caspase-1阳性表达无明显变化,神经元空泡变性,有几处自噬小体,细胞炎性坏死破裂产生的碎片状物质清晰易见,线粒体嵴脱落空泡变性。3-MA组大鼠海马区的NF-κB、NLRP3、IL-1β、IL-18表达明显升高(P<0.01,P<0.001,P<0.01,P<0.001),前额叶皮质的 NF-κB、NLRP3、IL-1β、IL-18 表达明显升高(P<0.001,P<0.01,P<0.05,P<0.001),说明在自噬水平被抑制的情况下,3-MA组大鼠海马区神经元炎症水平升高,海马区NLRP3、ASC-1、Caspase-1阳性表达明显增强,神经元核膜锯齿样弯曲,细胞器空泡化,核周间隙增宽,自噬小体未见,线粒体或细胞器周围碎片状炎性物质清晰可见,说明抑制自噬后,受损神经元炎症反应加重,促进了细胞从炎性坏死向凋亡的转变,从而使受损的神经元功能进一步恶化;与3-MA组相比,针刺+3-MA组大鼠海马区的NF-κκB、NLRP3、IL-1β、IL-18 表达明显升高(P<0.01,P<0.001,P<0.01,P<0.001),前额叶皮质的NF-κκB、NLRP3、IL-1β、IL-18 表达明显降低(P<0.001,P<0.05,P<0.05,P<0.001),海马区NLRP3、ASC-1、Caspase-1 阳性表达显著减弱,神经元核膜连续,核仁清晰可见,自噬小体增多,细胞破裂内容物少见,自噬小体明显增多,神经元炎性坏死现象偶见,证实了针刺可通过上调神经元自噬水平,抑制细胞炎性损伤,减缓缺血性PSD脑组织的炎症反应,改善缺血性PSD造成的神经功能缺损和抑郁症状。结论:神经炎症反应引起的神经元炎性坏死与缺血性PSD大鼠神经功能缺损和认知情感障碍、情志异常机制有关。帕罗西汀能通过抑制神经元凋亡改善缺血性PSD大鼠抑郁症状,且抑郁症状的缓解可能有利于减轻缺损神经功能的负担,但对于改善缺血缺氧脑损伤的本质未有明显的治疗作用,提示缺血性PSD的发病机制和抑郁症的发病机制有着本质的不同。针刺能有效改善缺血性PSD大鼠神经元的超微结构,缺损神经功能引起的肢体运动障碍和情志异常,其机制与激活神经元自噬流有关。针刺通过促进或挽救神经元自噬清除受损神经元,即自噬作为一种神经元保护因素抑制了神经元炎症反应,保护神经元免受炎性浸润损伤,改善缺血缺氧内环境,促进神经功能缺损的修复和改善缺血性中风后的抑郁症状,揭示了针刺改善缺血性PSD大鼠肢体运动障碍和抑郁症状的作用机制。