苹果酸是一种四碳二元羧酸,可以广泛应用于食品、医疗、化工、保健等多个领域。由于黑曲霉具有低p H耐受性、碳源利用多样性、遗传背景清晰、发酵工艺成熟等特点,近年来以黑曲霉作为细胞工厂生产L-苹果酸获得了广泛关注。研究表明,苹果酸的高效转运外泌过程是影响苹果酸发酵水平的重要一环。但由于目前缺乏对黑曲霉内四碳二元羧酸转运系统的研究,苹果酸高产菌株的构建受到了一定的限制。因此,研究黑曲霉内四碳二元羧酸转运蛋白对发展黑曲霉生产苹果酸具有重要意义。本文以来源于粟酒裂殖酵母的苹果酸转运蛋白Sp MAE1为模板序列,通过序列比对和结构域分析找到了黑曲霉内潜在的苹果酸转运体,并对它们的编码基因进行一系列的鉴定以及功能研究,最终确定了DCT1为黑曲霉内关键的苹果酸转运蛋白。本文的主要研究结果如下:（1）以来源于粟酒裂殖酵母的苹果酸转运蛋白为模板序列,在黑曲霉ATCC 1015中检索到了五个基因dct1、dct2、dct3、dct4、dct5,进行一系列分析后初步确定这五个基因是黑曲霉内编码四碳二元羧酸转运蛋白的关键基因。（2）对五个基因进行转录分析,在苹果酸发酵条件和柠檬酸发酵条件下,除了dct2,其他四个基因都能进行转录。（3）以实验室保存的质粒pLH594为出发载体,分别构建了dct1、dct3、dct4、dct5的敲除质粒。通过农杆菌介导的黑曲霉转化方法,获得相应的基因缺失突变株。（4）生长表型分析发现,变体菌株的生长、产孢和色素生成与野生型相比未发生显著变化。苹果酸发酵分析发现,在发酵3 d时,S1026（Δdct1）苹果酸滴度下降85.6%,同时副产物富马酸滴度下降95.9%,可见dct1的敲除几乎完全消除了苹果酸和富马酸的胞外积累,而dct3、dct4、dct5的敲除菌株苹果酸发酵水平无显著变化。由此我们确定DCT1为黑曲霉内主要的四碳二元羧酸转运蛋白。（5）由于dct1的敲除使黑曲霉苹果酸和富马酸的产量有着大幅度的降低,我们推测将dct1进行过表达可以有效地提高苹果酸和富马酸的产量。因此成功构建了带有自身启动子的dct1表达质粒p LH401以及dct1过表达菌株S1142,并对它进行摇瓶发酵分析。结果表明dct1的过表达菌株S1142摇瓶发酵3 d的苹果酸滴度相较出发菌株提高了25.4%,相比之下富马酸的滴度变化并不显著。由此我们进一步确定了DCT1的关键转运作用。