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目的：基于RNA-Seq技术分析大肠埃希菌温控调节蛋白HNS对携NDM-1的质粒IncX3传播的影响及其在细菌全局调控发挥的作用。
方法：本课题组前期构建携IncX3质粒的大肠埃希菌接合菌J330,HNS质粒敲除菌J330HNS,HNS质粒染色体双敲除菌J330HNS2。微量肉汤稀释法检测对9种抗菌药物的最低抑菌浓度(MIC),不同温度下(37℃，45℃)的生长曲线测定，96孔板结晶紫染色法分析生物膜形成能力，配置特殊泳动平板观察24h细菌移动性，采用蜡螟实验检测细菌毒力，并通过质粒接合转移实验计算质粒接合转移频率，竞争(适应性)实验测定细菌的适应性以及无抗性平板传代后提取DNA采用PCR技术检测质粒稳定性。采取高通量测序技术对J330和质粒染色体双敲除菌J330HNS2(Dkhns)进行转录组测序分析，将测序数据mapping到MG1655参考基因组上，获得各基因表达信息和基因表达定量，使用BGISEQ-500分析J330和Dkhns基因表达差异情况，找出表达差异基因中富集显著的GOterm条目,利用Pathway通路分析进一步了解差异基因相关的代谢通路，从而了解表达差异基因具体相关的生物学功能。
结果：3株细菌药敏谱相似，最低抑菌浓度(MIC)差异＜2倍，均对头孢菌素类和碳青霉烯类耐药。在37℃时，3株菌生长曲线接近，差异无统计学意义(P＞0.05)；45℃时生长曲线出现明显差异(P＜0.05),J330HNS和J330HNS2生长速度放慢，尤以J330HNS2为著，快慢依次为J330＞J330HNS＞J330HNS2。泳动实验表明，细菌在特殊平板上形成菌落直径大小分别为J330(15.59mm)、J330HNS(7.25mm)、J330HNS2(7.50mm)，后两者泳动能力弱于J330。生物膜及毒力实验显示，J330表现弱度产膜能力，J330HNS和J330HNS2为中度产膜能力，敲除菌产膜能力强于未敲除菌，差异有统计学意义(P＜0.05)。感染蜡螟后，72h存活率分别是J330(63.3%)、J330HNS(80%)、J330HNS2(96.7%)，未敲除菌J330毒力明显强于敲除菌，质粒单敲菌J330HNS毒力强于双敲除菌J330HNS2，差异有统计学意义(p＜0.05)。质粒接合实验显示，供体菌的质粒转移频率分别是J330(10-6 )、J330HNS(10-4)、J330HNS2(10-4)，单敲菌和双敲除菌结合频率均高于原代株。细菌竞争实验显示，三种菌适应性分别是WJ330=(0.73±0.02)、WJ330HNS=(0.36±0.02)、WJ330HNS2=(0.42±0.01)，敲除菌与未敲除菌差异有统计学意义(p＜0.05)，即敲除菌较未敲除菌适应性下降。转录组测序分析，每个样品平均产出21.72M数据，共得到4691个基因，比对基因组及比对基因集的平均比对率分别为98.54%，78.77%，定量曲线趋于饱和，测序序列实际覆盖度分布均匀，基因组覆盖率86.27%，低质量(Quality＜20)的碱基比例较低，说明测序数据良好，基本能反映所测细菌整个转录组情况。根据FPKM值进行样本间表达基因相关性分析，J330和J330HNS2(此处命名为Dkhns)基因表达相关系数为0.978，Dkhns与J33O相比差异表达基因共有308个，上调基因170个，下调基因138个，对差异基因进行GO功能和Pathway显著性富集分析，主要基因差异有：细菌氨基酸以及碳水化合物代谢相关基因，细胞运动性、趋化性、双组分系统以及T4SS分泌系统等相关基因。HNS对于细菌生长呈温度调控，HNS突变株运动性、毒力、适应性均下降，但是生物膜产膜能力增强，同时HNS突变有助于质粒接合转移。转录组测序显示差异基因主要集中在细菌运动性、趋化性、T4SS分泌系统、双组分系统以及代谢特别是氨基酸，碳水化合物代谢中。
结论：1.失去质粒HNS导致了细菌的适应性下降，出现适应性代价的表型改变，即细菌的运动能力，毒力，生长速率均下降，同时增加了质粒的接合转移频率，但是双敲菌产生的变化较之单敲除菌更显著，可见质粒上的HNS与染色体HNS对于细菌都有一定的调控作用，并且可能存在互补功能.
2.细菌HNS是一个全局性转录调控因子，参与大肠埃希菌中的多个基因的转录调控，质粒和染色体HNS缺失会导致多种代谢通路变化，及细菌运动趋化性改变，同时对IncX3质粒的传播和适应性存在影响。
方法：本课题组前期构建携IncX3质粒的大肠埃希菌接合菌J330,HNS质粒敲除菌J330HNS,HNS质粒染色体双敲除菌J330HNS2。微量肉汤稀释法检测对9种抗菌药物的最低抑菌浓度(MIC),不同温度下(37℃，45℃)的生长曲线测定，96孔板结晶紫染色法分析生物膜形成能力，配置特殊泳动平板观察24h细菌移动性，采用蜡螟实验检测细菌毒力，并通过质粒接合转移实验计算质粒接合转移频率，竞争(适应性)实验测定细菌的适应性以及无抗性平板传代后提取DNA采用PCR技术检测质粒稳定性。采取高通量测序技术对J330和质粒染色体双敲除菌J330HNS2(Dkhns)进行转录组测序分析，将测序数据mapping到MG1655参考基因组上，获得各基因表达信息和基因表达定量，使用BGISEQ-500分析J330和Dkhns基因表达差异情况，找出表达差异基因中富集显著的GOterm条目,利用Pathway通路分析进一步了解差异基因相关的代谢通路，从而了解表达差异基因具体相关的生物学功能。
结果：3株细菌药敏谱相似，最低抑菌浓度(MIC)差异＜2倍，均对头孢菌素类和碳青霉烯类耐药。在37℃时，3株菌生长曲线接近，差异无统计学意义(P＞0.05)；45℃时生长曲线出现明显差异(P＜0.05),J330HNS和J330HNS2生长速度放慢，尤以J330HNS2为著，快慢依次为J330＞J330HNS＞J330HNS2。泳动实验表明，细菌在特殊平板上形成菌落直径大小分别为J330(15.59mm)、J330HNS(7.25mm)、J330HNS2(7.50mm)，后两者泳动能力弱于J330。生物膜及毒力实验显示，J330表现弱度产膜能力，J330HNS和J330HNS2为中度产膜能力，敲除菌产膜能力强于未敲除菌，差异有统计学意义(P＜0.05)。感染蜡螟后，72h存活率分别是J330(63.3%)、J330HNS(80%)、J330HNS2(96.7%)，未敲除菌J330毒力明显强于敲除菌，质粒单敲菌J330HNS毒力强于双敲除菌J330HNS2，差异有统计学意义(p＜0.05)。质粒接合实验显示，供体菌的质粒转移频率分别是J330(10-6 )、J330HNS(10-4)、J330HNS2(10-4)，单敲菌和双敲除菌结合频率均高于原代株。细菌竞争实验显示，三种菌适应性分别是WJ330=(0.73±0.02)、WJ330HNS=(0.36±0.02)、WJ330HNS2=(0.42±0.01)，敲除菌与未敲除菌差异有统计学意义(p＜0.05)，即敲除菌较未敲除菌适应性下降。转录组测序分析，每个样品平均产出21.72M数据，共得到4691个基因，比对基因组及比对基因集的平均比对率分别为98.54%，78.77%，定量曲线趋于饱和，测序序列实际覆盖度分布均匀，基因组覆盖率86.27%，低质量(Quality＜20)的碱基比例较低，说明测序数据良好，基本能反映所测细菌整个转录组情况。根据FPKM值进行样本间表达基因相关性分析，J330和J330HNS2(此处命名为Dkhns)基因表达相关系数为0.978，Dkhns与J33O相比差异表达基因共有308个，上调基因170个，下调基因138个，对差异基因进行GO功能和Pathway显著性富集分析，主要基因差异有：细菌氨基酸以及碳水化合物代谢相关基因，细胞运动性、趋化性、双组分系统以及T4SS分泌系统等相关基因。HNS对于细菌生长呈温度调控，HNS突变株运动性、毒力、适应性均下降，但是生物膜产膜能力增强，同时HNS突变有助于质粒接合转移。转录组测序显示差异基因主要集中在细菌运动性、趋化性、T4SS分泌系统、双组分系统以及代谢特别是氨基酸，碳水化合物代谢中。
结论：1.失去质粒HNS导致了细菌的适应性下降，出现适应性代价的表型改变，即细菌的运动能力，毒力，生长速率均下降，同时增加了质粒的接合转移频率，但是双敲菌产生的变化较之单敲除菌更显著，可见质粒上的HNS与染色体HNS对于细菌都有一定的调控作用，并且可能存在互补功能.
2.细菌HNS是一个全局性转录调控因子，参与大肠埃希菌中的多个基因的转录调控，质粒和染色体HNS缺失会导致多种代谢通路变化，及细菌运动趋化性改变，同时对IncX3质粒的传播和适应性存在影响。