论文部分内容阅读
目的：
1.探究流式细胞术(Flow cytometry，FCM)检测结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，MTB)利福平(Rifampicin，RFP)药敏的准确性；2.探究FCM检测MTBRFP异质性耐药的可行性,为FCM在MTB药敏检测及异质性耐药检测中的应用提供实验依据。方法：1.应用FCM检测MTBRFP药敏的研究。①应用荧光素双醋酸酯(Fluorescein diacetae，FDA)、6-羧基荧光素二乙酸酯(6-carboxyfluorescein diacetate，6-cFDA)和碘化丙啶(Propidium iodide，PI)分别对10株1麦氏浊度MTB纯培养活菌悬液和其相应的1麦氏浊度85℃加热30min的死菌悬液进行染色，应用FCM检测其平均荧光强度(Mean fluorescence intensity，MFI)，依据受试者工作特征曲线(Receiver operating characteristic curve，ROC)确定区分死菌与活菌的MFI界值，然后对另外10株活菌悬液和10株死菌悬液进行相同实验，利用前述MFI界值进行细菌死、活判定。②通过FCM检测MTB临床分离全敏株与耐RFP株菌悬液在不同RFP浓度及不同时间处理后，经FDA或PI染色的MFI值，并计算其敏感指数(敏感指数=实验管MFI/对照管MFI)，依据ROC曲线统计各药物浓度及处理时间下该方法鉴定MTBRFP敏感性的诊断性能，分别选择基于两种染料药敏实验的最佳RFP处理浓度及时间，计算其鉴定MTBRFP敏感性的界值。③按照上述药敏实验条件检测药敏信息未知MTB临床分离株的RFP敏感性，并与比例法结果进行比较，通过卡方检验评估这两种RFP药敏检测方法的诊断性能。2.应用FCM检测MTBRFP异质性耐药的研究。①将4株MTB临床分离株活菌菌悬液及其加热处死的死菌悬液按一定比例混合得到MTB异质菌液(其中活菌比例分别为0%、25%、50%、75%和100%)，应用FDA或PI对其染色，流式细胞仪检测其MFI。双变量直线回归分析得到MFI比值(染色后MFI值与其对应100%活菌样本MFI值的比值)与实际活菌比例之间的直线回归方程，并采用方差分析对回归模型进行检验，初步评估该方法用于MTB异质性菌液检测的可行性。②为了确定基于两种染料的FCM检测MTBRFP异质性耐药所使用的最佳RFP处理浓度及作用时间，对第一部分中MTB临床株经不同浓度RFP处理不同时间后，FDA或PI染色的敏感指数进行差异性分析，选择不影响MTBRFP耐药临床株生长，但使得MTB敏感株活力最差的RFP处理浓度及时间。③将30株MTB临床分离敏感菌和30株临床分离耐RFP株菌悬液按一定比例混合得到MTB异质性耐药菌液(其中耐RFPMTB比例分别为0%、25%、50%、75%和100%)，于特定终浓度RFP中处理一定时间，应用FDA或PI染色，流式细胞仪检测其MFI并计算敏感指数，依据ROC曲线确定区分不同比例异质菌液之间的敏感指数界值及检测性能，初步评估流式法检测MTBRFP异质性耐药的可行性。
结果：
1.应用FCM检测MTBRFP药敏的研究。①FDA、6-cFDA和PI鉴定活、死菌的MFI界值分别为1834、1021和1329；应用以上界值判断另外10株活、死菌，FDA、6-cFDA和PI的准确度分别为100%、100%和95%。②基于FDA的FCM鉴别MTBRFP敏感性的最佳条件是12.5μg/mL的RFP处理7天，该条件下区分MTBRFP敏感或耐药的敏感指数界值为0.75。以此条件对95株未知药敏信息的MTB临床分离株进行检测，与比例法相比两种方法之间无差异(x2=0.364，P=0.549)，其检测准确度为88.4%，灵敏度为90.2%，特异度为87.0%。③基于PI的FCM鉴别MTB对RFP敏感性的最佳条件是1.56μg/mL的RFP处理1天，该条件下区分MTBRFP敏感或耐药的敏感指数界值为1.12。以此条件对78株未知药敏信息的MTB临床分离株进行检测，与比例法比较两种方法之间无差异(x2=0.083，P=0.7745)，其检测准确度为84.6%，灵敏度为85.7%，特异度为83.7%。2.应用FCM检测MTBRFP异质性耐药的研究。①4组不同活菌比例的MTB异质菌液样本经FDA染色后的MFI值与其对应100%活菌样本MFI值的比值(Y)与活菌比例(X)之间的直线回归方程为?FDA=0.01+0.977XFDA，该直线回归方程具有统计学意义(P=0.000)。同样，利用基于PI的FCM检测4组异质菌液，其直线回归方程为?PI=0.971-0.983XPI，该直线回归方程具有统计学意义(P=0.001)。说明基于FDA或PI的FCM具有检测MTB异质菌液的潜力。②对经不同RFP浓度及不同时间处理后，各MTB临床分离株经FDA或者PI染色后的敏感指数进行差异性分析，结果表明基于FDA的FCM应用于MTBRFP异质性耐药检测的最佳RFP处理浓度为50μg/mL和最佳作用时间为10天；以50μg/mL的RFP处理10天时，该方法可指示RFP耐药菌比例大于25%的MTB异质菌液，该条件下该方法检测的敏感度为96.2%，特异度为96.7%；处理14天时该方法可指示RFP耐药菌比例大于25%的MTB异质菌液，该方法检测的敏感度为96.7%，特异度为93.3%。③基于PI的FCM应用于MTBRFP异质性耐药检测的最佳药物浓度为25μg/mL，最佳处理时间为3天和7天。在此条件下，基于PI的FCM不可区分含不同比例RFP耐药菌的MTB异质菌液样本，该方法对MTB异质菌液样本的检测性能较低。
结论：
1.基于FDA或PI的FCM均可应用于MTB临床分离株的RFP敏感性检测，与PI相比FDA的检测效能较好，但是所需时间较长。该方法比比例法快速高效。2.基于FDA的FCM可较好的指示耐RFPMTB比例大于25%的MTB异质菌液，而基于PI的FCM法在这方面检测效能较差。FCM在MTB药敏检测及异质性耐药检测中具有广阔的应用前景。
1.探究流式细胞术(Flow cytometry，FCM)检测结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，MTB)利福平(Rifampicin，RFP)药敏的准确性；2.探究FCM检测MTBRFP异质性耐药的可行性,为FCM在MTB药敏检测及异质性耐药检测中的应用提供实验依据。方法：1.应用FCM检测MTBRFP药敏的研究。①应用荧光素双醋酸酯(Fluorescein diacetae，FDA)、6-羧基荧光素二乙酸酯(6-carboxyfluorescein diacetate，6-cFDA)和碘化丙啶(Propidium iodide，PI)分别对10株1麦氏浊度MTB纯培养活菌悬液和其相应的1麦氏浊度85℃加热30min的死菌悬液进行染色，应用FCM检测其平均荧光强度(Mean fluorescence intensity，MFI)，依据受试者工作特征曲线(Receiver operating characteristic curve，ROC)确定区分死菌与活菌的MFI界值，然后对另外10株活菌悬液和10株死菌悬液进行相同实验，利用前述MFI界值进行细菌死、活判定。②通过FCM检测MTB临床分离全敏株与耐RFP株菌悬液在不同RFP浓度及不同时间处理后，经FDA或PI染色的MFI值，并计算其敏感指数(敏感指数=实验管MFI/对照管MFI)，依据ROC曲线统计各药物浓度及处理时间下该方法鉴定MTBRFP敏感性的诊断性能，分别选择基于两种染料药敏实验的最佳RFP处理浓度及时间，计算其鉴定MTBRFP敏感性的界值。③按照上述药敏实验条件检测药敏信息未知MTB临床分离株的RFP敏感性，并与比例法结果进行比较，通过卡方检验评估这两种RFP药敏检测方法的诊断性能。2.应用FCM检测MTBRFP异质性耐药的研究。①将4株MTB临床分离株活菌菌悬液及其加热处死的死菌悬液按一定比例混合得到MTB异质菌液(其中活菌比例分别为0%、25%、50%、75%和100%)，应用FDA或PI对其染色，流式细胞仪检测其MFI。双变量直线回归分析得到MFI比值(染色后MFI值与其对应100%活菌样本MFI值的比值)与实际活菌比例之间的直线回归方程，并采用方差分析对回归模型进行检验，初步评估该方法用于MTB异质性菌液检测的可行性。②为了确定基于两种染料的FCM检测MTBRFP异质性耐药所使用的最佳RFP处理浓度及作用时间，对第一部分中MTB临床株经不同浓度RFP处理不同时间后，FDA或PI染色的敏感指数进行差异性分析，选择不影响MTBRFP耐药临床株生长，但使得MTB敏感株活力最差的RFP处理浓度及时间。③将30株MTB临床分离敏感菌和30株临床分离耐RFP株菌悬液按一定比例混合得到MTB异质性耐药菌液(其中耐RFPMTB比例分别为0%、25%、50%、75%和100%)，于特定终浓度RFP中处理一定时间，应用FDA或PI染色，流式细胞仪检测其MFI并计算敏感指数，依据ROC曲线确定区分不同比例异质菌液之间的敏感指数界值及检测性能，初步评估流式法检测MTBRFP异质性耐药的可行性。
结果：
1.应用FCM检测MTBRFP药敏的研究。①FDA、6-cFDA和PI鉴定活、死菌的MFI界值分别为1834、1021和1329；应用以上界值判断另外10株活、死菌，FDA、6-cFDA和PI的准确度分别为100%、100%和95%。②基于FDA的FCM鉴别MTBRFP敏感性的最佳条件是12.5μg/mL的RFP处理7天，该条件下区分MTBRFP敏感或耐药的敏感指数界值为0.75。以此条件对95株未知药敏信息的MTB临床分离株进行检测，与比例法相比两种方法之间无差异(x2=0.364，P=0.549)，其检测准确度为88.4%，灵敏度为90.2%，特异度为87.0%。③基于PI的FCM鉴别MTB对RFP敏感性的最佳条件是1.56μg/mL的RFP处理1天，该条件下区分MTBRFP敏感或耐药的敏感指数界值为1.12。以此条件对78株未知药敏信息的MTB临床分离株进行检测，与比例法比较两种方法之间无差异(x2=0.083，P=0.7745)，其检测准确度为84.6%，灵敏度为85.7%，特异度为83.7%。2.应用FCM检测MTBRFP异质性耐药的研究。①4组不同活菌比例的MTB异质菌液样本经FDA染色后的MFI值与其对应100%活菌样本MFI值的比值(Y)与活菌比例(X)之间的直线回归方程为?FDA=0.01+0.977XFDA，该直线回归方程具有统计学意义(P=0.000)。同样，利用基于PI的FCM检测4组异质菌液，其直线回归方程为?PI=0.971-0.983XPI，该直线回归方程具有统计学意义(P=0.001)。说明基于FDA或PI的FCM具有检测MTB异质菌液的潜力。②对经不同RFP浓度及不同时间处理后，各MTB临床分离株经FDA或者PI染色后的敏感指数进行差异性分析，结果表明基于FDA的FCM应用于MTBRFP异质性耐药检测的最佳RFP处理浓度为50μg/mL和最佳作用时间为10天；以50μg/mL的RFP处理10天时，该方法可指示RFP耐药菌比例大于25%的MTB异质菌液，该条件下该方法检测的敏感度为96.2%，特异度为96.7%；处理14天时该方法可指示RFP耐药菌比例大于25%的MTB异质菌液，该方法检测的敏感度为96.7%，特异度为93.3%。③基于PI的FCM应用于MTBRFP异质性耐药检测的最佳药物浓度为25μg/mL，最佳处理时间为3天和7天。在此条件下，基于PI的FCM不可区分含不同比例RFP耐药菌的MTB异质菌液样本，该方法对MTB异质菌液样本的检测性能较低。
结论：
1.基于FDA或PI的FCM均可应用于MTB临床分离株的RFP敏感性检测，与PI相比FDA的检测效能较好，但是所需时间较长。该方法比比例法快速高效。2.基于FDA的FCM可较好的指示耐RFPMTB比例大于25%的MTB异质菌液，而基于PI的FCM法在这方面检测效能较差。FCM在MTB药敏检测及异质性耐药检测中具有广阔的应用前景。