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神经系统的损伤及神经变性疾病都需要进行神经功能的恢复治疗。细胞治疗及组织工程的出现为此类患者提供了新的选择，其中种子细胞的选择是一大关键因素。理想的种子细胞应具备来源丰富、易获取、增殖力强、可多向分化的特点。肌源性干细胞(Muscle-derived stem cell，MDSC)便是其中一种近年来被发现并逐渐成为研究热点的新型种子细胞。
本课题从新西兰兔肌肉中分离并纯化出：MDSC，将其诱导分化为神经细胞，探索其纯化方法及分化特性。实验内容分为以下两个部分：
1.MDSC的分离、培养、纯化及鉴定
2.MDSC体外诱导分化为神经细胞
第一章 兔MDSC的分离、培养、纯化及鉴定
实验动物及材料：2～3周龄新西兰兔，体重约0.7～1kg；Ⅺ型胶原酶(Sigma)、Dispase(Roche)、Trypsin(Gibco)；小鼠抗Desmin(博士德)、兔抗bcl-2(博士德)；马血清(HS，Hyclone)、胎牛血清(FBS，四季青)；DMEM-LG；25CM2赖氨酸表面处理细胞培养瓶。
方法：采用改进的酶消化及Preplating技术分离MDSC：无菌条件下取新西兰兔大腿肌肉并剪成肉泥，依次用Ⅺ型胶原酶、Dispase及rrypsin／EDTA进行消化，每次消化之间离心并取糊状上清进行下一步消化，最后离心取沉淀，用培养基重悬后接种于经赖氨酸表面处理的培养瓶，此为PPl；细胞培养箱中孵育2h后将PP1中的悬液转移至新的培养瓶，此为PP2；之后每隔24h将悬液转移至新的培养瓶，此为PP3～PP6。收集PP6细胞继续培养并于传代时应用差速贴壁法再次纯化，并进行流式细胞仪(FCM)、免疫细胞化学检测确定细胞表型。
结果：经过连续6d的差速贴壁分离得到短梭形及小菱形的小体积细胞，传代后进一步纯化。FCM结果显示PP6细胞的desmin、bc1-2及CD45的阳性率分别为97.474-0.22％、96.18+0.1l％及1.19±0.05％。免疫细胞化学检测显示大多数细胞为desmin及bcl-2阳性。
结论：采用改进的酶消化及Preplating技术能很好地分离并纯化出MDSC。
第二章MDSC体外诱导分化为神经细胞
实验试剂及器材：B27、全反式维甲酸(ATRA)、β-巯基乙醇、Neurobasal培养基；小鼠抗Nestin、Cy3-羊抗小鼠IgG；流式细胞仪、超净台、荧光显微镜等。
方法：采用添加诱导剂直接诱导分化的方法：将第3代MDSC接种到六孔板，添加含2.51μM全反式维甲酸，2.5mMβ-巯基乙醇及2％B27的诱导培养基，分两组观察：A组3天后换用Neurobasal(含2％B27)培养基继续培养，B组2天后换用Neurobasal(含2％B27)培养基继续培养。对诱导共6d的细胞进行FCM及免疫细胞化学检测Nestin的表达情况。
结果：诱导处理后的细胞表达Nestin，FCM结果显示A、B两组阳性率分别为94.67±2.40％及87.88±5.62％，免疫细胞化学检测可见很多nestin阳性细胞。
结论： MDSC能够在体外被诱导分化为神经细胞。