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犏牛是牦牛与黄牛的杂交一代（F1）,外形介于双亲之间,躯体高大,整体结构匀称。犏牛具有明显的杂交优势,其乳、肉生产能力及役用能力优于牦牛,但F1代犏牛为雄性不育。雄性不育限制了其基因流动,对杂交改良家养牦牛的工作提出了挑战。研究犏牛雄性不育的机制,对牦牛的杂交育种具有重要意义。因此,鉴定和确定生殖细胞发育过程中,尤其是基因重组途径中的关键调节因子表达,是探索犏牛杂交雄性不育机制的基础。Spata22、Rad51和DMC1基因及其相互作用的调控因子在减数分裂的前期I中起着至关重要的作用,这些蛋白质在双链断裂位点积累,有助于双链断裂修复和促进减数分裂重组。目前,国内外研究尚未对Spata22、Rad51和DMC1在犏牛中的表达分布及功能特点进行探索。因此,本工作旨在通过克隆分析犏牛Spata22、Rad51、DMC1基因序列,以及检测其上游调控因子在性成熟前后的犏牛、黄牛和牦牛睾丸中的定位和表达,结合睾丸形态学参数的比较分析,揭示犏牛不育的相关机制。为了实现这一目标,使用基因克隆、q RT-PCR、Western印迹、免疫组织化学、免疫荧光、TUNEL标记等技术和组织形态学分析方法进行了三部分实验。主要结果总结如下:1.组织形态学显示,黄牛和牦牛的生殖上皮细胞组成和结构没有差异,不同发育期的生殖细胞、支持细胞和间质细胞均正常。相比之下,犏牛曲精小管中分布有精原细胞和极少的初级精母细胞,而没有观察到发育晚期的次级精母细胞、精子细胞和精子。进一步观察发现,生殖细胞的细胞核呈明显的高度浓缩,属于细胞退化和凋亡的典型特征。黄牛和牦牛的曲精小管中分布有大量的未成熟的生精细胞和成熟的精子细胞。成年犏牛曲精小管中精原细胞占比45.6%、精母细胞占比33.1%、支持细胞占比21.3%。未成年的犏牛曲精小管中,精原细胞、精母细胞和支持细胞分别占比38.7%、36.2%、25.1%。这表明生殖细胞的数量随着年龄的增长而逐渐减少,通过激活细胞凋亡途径导致生殖细胞死亡。2.不同物种和年龄组的曲细精管形态比较显示,曲细精管直径、小管横截面积和横截面周长无显著差异。然而,与同年龄组的黄牛和牦牛相比,犏牛的曲细精管管腔面积和管腔周长明显扩大,犏牛曲细精管上皮厚度明显降低。3.基因克隆犏牛Spata22和Rad51编码区（CDS）序列。生物信息学分析显示,犏牛和黄牛Rad51序列的同源性完全相同,未发现基因突变位点,而犏牛Spata22序列中含有13个基因突变位点与黄牛序列对比。生物发育进化分析表明犏牛与牛科其他成员如野牦牛和水牛处于同级分类。4.通过q RT-PCR技术检测性成熟和未性成熟犏牛、牦牛和黄牛睾丸组织中Spata22、Rad51和DMC1、共定位因子和及上游调节因子（MEIOB、BRME1、BRCA2和HSF2BP）的表达。性成熟和未性成熟犏牛、牦牛和黄牛相比,犏牛组中上述所有基因m RNA表达均明显下调。在性腺（睾丸和卵巢）及部分其他组织器官（肾、肝、脾、肺和心脏）中检测了上述基因表达的组织特异性。结果显示,Spata22、MEIOB、HSF2BP、BRME1和DMC1仅在睾丸和卵巢中表达,而Rad51和BRCA2无组织特异性,在所有被检组织中均有表达。另外,Spata22、MEIOB、Rad51和DMC1在睾丸中表达量高于卵巢。5.采用Western blot、免疫组化（IHC）和免疫荧光（IF）方法对Spata22、Rad51和DMC1蛋白进行表达和定位研究。Western blot结果表明,在牦牛和黄牛中Spata22、Rad51和DMC1的蛋白表达水平更高,结果与三者m RNA表达趋势保持一致。免疫组化（IHC）和免疫荧光（IF）结果显示,Spata22、Rad51和DMC1主要在精原细胞、初级精母细胞、次级精母细胞中表达,在圆形精子细胞和精子中未见表达。这与先前研究中上述蛋白质在精母细胞粗线期晚期的胞内耗尽的结果一致,且牦牛和黄牛睾丸中Spata22、Rad51和DMC1阳性反应强度要高于犏牛睾丸。6.为了进一步探究犏牛精母细胞减数分裂停滞期,该试验对犏牛睾丸组织中组蛋白HIST1H1T（H1t）和Hox A4（粗线期中期标志物）和Cdc25c（粗线期晚期标志物）表达水平检测。结果显示,在犏牛睾丸中未检测到上述粗线期标志物m RNA的表达,而在牦牛和黄牛睾丸中检测到了上述因子,证明犏牛减数分裂阻滞发生在粗线期或之前。7.该实验通过TUNEL染色和q RT-PCR技术检测了生殖细胞凋亡水平和凋亡相关基因的表达情况。犏牛生精小管中TUNEL染色呈强阳性,主要分布于生精上皮的基底部和中部,表明精原细胞和初级、次级精母细胞均发生凋亡。此外,与黄牛、牦牛睾丸相比,犏牛睾丸中发生凋亡的阳性细胞数量明显多。这表明犏牛睾丸中大量生殖细胞正在通过凋亡方式发生死亡。而基因重组障碍是由初级精母细胞通过p53依赖性凋亡途径引起。与黄牛和牦牛相比,犏牛睾丸中p53和Bax的m RNA表达水平更高,此外,还发现黄牛和牦牛的睾丸组织中Bcl-2的表达水平明显低于犏牛,这表明犏牛睾丸生殖细胞中,细胞凋亡的通路被激活或者抑制细胞凋亡的信号通被阻断。结论:（1）成功克隆了犏牛Spata22和Rad51的编码区（CDS）序列,Rad51序列未发现突变位点,而Spata22序列含有13个突变位点。（2）犏牛睾丸发育过程中伴有大量生殖细胞凋亡,致其曲细精管的管腔面积和周长明显扩大,生精上皮厚度明显降低,不利于精子发生,最终曲精小管中未发现除精原细胞、初级精母细胞以外的生精细胞。（3）由于Spata22、Rad51和DMC1及相关调控因子在犏牛精子发生的动态过程中的低表达,抑制了精母细胞减数分裂进程,使得犏牛精子发生最终停滞在第一次减数分裂粗线期或之前。