1.研究背景与研究目的我国近30年来高能耗产业的迅速发展带来严重的环境污染,以细颗粒物（Fine particulate matter,PM）为代表的大气污染物对公众健康的影响也成为我国非常重要的公共卫生问题。可进入人体血液循环系统的超细颗粒物（Ultrafine particulate matter,UPM）,能够阻碍正常的血液循环,进而引发高血压、冠心病等心血管疾病。心肌缺血患者等高危人群暴露于PM环境下时,心肌梗死发病率、死亡率都明显增加。但PM加重心肌缺血的毒理机制目前尚不明确,相关药物干预尚属起步阶段。本课题组前期研究表明,益气养阴方“生脉饮”在治疗PM加重心肌缺血中具有良好疗效,而其作用机制有待进一步阐明。本研究首先采用转录组学和蛋白组学结合的研究方法,深入挖掘前期PM复合心肌缺血动物模型中PM加重心肌缺血的毒理机制,包括关键的生物学通路和分子靶点。通过生物信息学分析,结合大量已报道的PM毒理学文献资料,筛选获得S100A8/A9等分子,推测其在PM加重心肌缺血中起重要作用。在此基础上,进一步利用PM暴露复合心肌缺血动物模型,通过探究S100A8/A9水平的表达变化,验证PM暴露复合心肌缺血后S100A8/A9水平与心肌缺血性损伤之间的关联,并通过生脉饮给药干预,探究生脉饮治疗PM加重心肌缺血的药理作用是否与S100A8/A9分子表达相关。2.研究方法2.1.组学技术挖掘分析细颗粒物暴露复合心肌缺血模型的毒理机制2.1.1.细颗粒物暴露复合心肌缺血模型特征的组学分析利用课题组前期实验中通过PM气管滴注结合冠状动脉左前降支结扎建立的大鼠PM暴露复合心肌缺血模型（Myocardial ischemia,MI）心肌组织样本,提取总mRNA和总蛋白,进行转录组测序和定量蛋白质组学检测。比较分析转录组学和蛋白组学数据,获得差异表达的mRNA和蛋白,深入挖掘PM暴露加重心肌缺血的毒理机制,筛选PM相关毒理作用的关键分子。2.1.2.细粒物暴露加重心肌缺血的关键靶点初步验证利用相同造模方法建立的C57/BL6N小鼠PM暴露复合MI模型心肌组织,提取总mRNA,根据组学分析结果,使用RealtimeqPCR（RT-qPCR）对关键分子进行筛选验证。2.2.S100A8/A9在细颗粒物加重心肌缺血损伤中的作用分析C57/BL6N小鼠随机分为Sham组,PM组,MI组,MI+PM组,适应性喂养后,于第二周进行两次PM暴露,第三周进行心肌缺血造模,造模48h后取材,进行以下检测:（1）TTC染色评价心肌缺血模型是否建立成功;（2）HE染色观察小鼠肺组织和心肌组织病理;（3）ELISA法检测小鼠血清S100A8/9分子水平;（4）免疫荧光检测小鼠心肌组织S100A9表达Ly6g 阳性细胞浸润,并进行S100A9与Ly6g共定位;（5）RT-qPCR检测小鼠心肌组织S100A8,S100A9,TLR4,Cxcl2,Cxcl3,Ccl2,G-CSF,IL-1β,IL-6 基因表达水平;（6）Western-blot 与 Simple Western 检测小鼠心肌组织 HIF-1α,RAGE,TLR4,NF-κB,p-NF-κB蛋白表达水平。2.3.生脉饮对细颗粒物加重心肌缺血性损伤及对S100A8/A9表达的干预作用2.3.1.生脉饮对PM暴露复合心肌缺血小鼠模型的干预机制研究C57/BL6N小鼠随机分为Sham组,MI+PM组,SM组（给药生脉饮,7.8 mL/kg）,PAQ组（给药帕奎莫德,10 mg/kg）以及PAQ+SM组,观察给药后:（1）TTC染色判断小鼠心肌缺血模型是否建立成功;（2）HE染色观察小鼠心肌组织和肺组织病理状况;（3）ELISA法检测小鼠血清S100A8/9分子水平;（4）免疫荧光检测小鼠心肌组织S100A9表达Ly6g阳性细胞浸润,并进行S100A9与Ly6g共定位;（5）RT-qPCR检测检测小鼠心肌组织S100A8,S100A9,TLR4,Cxc12,Cxcl3,Ccl2,G-CSF,IL-1β,IL-6 mRNA 表达水平;（6）Western-blot与 Simple Western 检测 HIF-1α,RAGE,TLR4,NF-κB p65,p-NF-κB p65 蛋白表达水平的变化,并通过与帕奎莫德对比,分析生脉饮治疗PM加重心肌缺血性损伤作用与S100A8/A9的相关性。2.3.2.生脉饮通过S100A8/A9对H9c2细胞PM暴露复合糖氧剥夺模型细胞损伤的干预机制研究以心肌细胞H9c2细胞为研究对象,将细胞分为NC组,PM组,LO组,LO+PM 组,PAQ 组,SM（1 μg/mL）组,SM（2 μg/mL）组,SM（4 μg/mL）组,通过在培养基中添加PM（浓度25 μg/mL）孵育24 h模拟PM暴露,利用糖氧剥夺8 h模拟心肌缺血,通过观察细胞形态变化,RT-qPCR检测细胞S100A8,S100A9mRNA 表达水平,Simple Western 检测 RAGE,NF-κB p65,p-NF-κB p65蛋白表达水平的变化,探究体外心肌细胞对PM暴露复合缺血缺氧损伤的反应与S100A8/A9的相关性,以及生脉饮的干预作用。3.研究结果3.1.组学技术挖掘分析细颗粒物暴露复合心肌缺血模型的毒理学特征综合转录组和蛋白组学的生物信息学分析结果,通过差异基因或蛋白的相对表达量分析、PPI互作网络构建、GO富集、KEGG富集,获得PM暴露模型发生显著变化的生物学过程并富集到该过程涉及的关键分子,具体如下:趋化因子信号通路（Cxcl2,Cxc13,S100A8,S100A9,Vegfa,C5,Lgals3,Pf4）、细胞凋亡（Bc1211,Vegfa,Bc12111,S100A8,S100A9,Rnf34,Casp2,Becn1,Apip,Xiap,Ntn1）、利钠肽（Npr3,Atp1a2,Corin,Tnni3k,Agt,Nppb,Nppa）、血管生成（C3,Lgals3,C5,Flt1,Vegfa,Pgf,Nppb,Agt,Pf4）、补体-凝血级联（C9,C7,C5,C4a,C3,Serping1,Serpine1,F2,Crp）。根据RT-qPCR验证结果,推测S100A8、S100A9是PM暴露加重心肌缺血的关键分子。3.2.S100A8/A9在细颗粒物加重心肌缺血损伤中的作用在PM暴露复合心肌缺血小鼠模型中:（1）TTC染色结果显示,Sham组和PM组呈红色,无明显缺血区;MI组和MI+PM组整体颜色苍白,有显著的缺血区。（2）肺、心脏组织病理:Sham组肺组织结构完整,肺泡壁薄,相较于Sham组,PM组和MI+PM组肺泡壁明显增厚,结构散乱,显示PM暴露造成肺部损伤;Sham组心肌组织结构完整,心肌细胞排列整齐,肌肉横纹清晰,无组织坏死和炎症组织浸润,MI+PM组相较于Sham组可见明显心肌纤维断裂和细胞坏死,伴有明显的出血、炎症浸润和结缔组织增生,相较于MI组心肌结构损伤和炎症浸润更加严重。（3）PM暴露复合心肌缺血模型中S100A8/A9表达水平变化:MI+PM组相较于Sham组心肌组织可见大量S100A9阳性表达,心肌组织S100A9阳性细胞率有明显上调（P＜0.001）,平均荧光强度明显增加（P＜0.001）,S100A8 mRNA 显著上调（P＜0.001）,S100A9 mRNA 显著上调（P＜0.001）;相较于MI组心肌组织,S100A9阳性细胞率、平均荧光强度差别有统计学意义（P＜0.005,P＜0.05）,S100A8和S100A9 mRNA表达水平差别有统计学意义（P＜0.05,P＜0.001）。（4）对心肌组织Ly6g 阳性细胞浸润的影响:MI+PM组相较于Sham组心肌组织Ly6g表达增强,心肌组织Ly6g 阳性表达细胞率明显上调（P＜0.001）,荧光强度增强（P＜0.001）;相较于MI组阳性细胞表达率、荧光强度差别有统计学意义（P＜0.001,P＜0.001）。（5）心肌组织S100A9与Ly6g共定位:各组心肌组织S100A9与Ly6g皮尔森系数和曼德斯重合系数介于0.6-0.8,显示S100A9与Ly6g存在共定位。（6）对S100A8/A9上下游通路相关因子的影响:MI+PM组与Sham组相比,心肌组织RAGE下调（P＜0.005）;TLR4mRNA和蛋白表达水平无显著变化;NF-κB p65磷酸化水平升高（P＜0.05）。MI+PM组相较于Sham组,心肌组织趋化因子G-CSF、Cc12、Cxc12、Cxc13 水平升高（P＜0.05,P＜0.005,P＜0.05,P＜0.001）;炎症因子 IL-1β和IL-6水平显著升高（P＜0.001,P＜0.001）;相较于MI组IL-6和Cc12进一步上调（P＜0.001,P＜0.005）,Cxc12 表达下调（P＜0.001）。3.3.生脉饮对细颗粒物加重心肌缺血性损伤的干预作用PM暴露复合心肌缺血模型小鼠在生脉饮干预后:（1）TTC染色结果显示,SM组、PAQ组以及PAQ+SM组缺血区有不同程度改善。（2）肺、心脏组织病理:相较于MI+PM组,SM组肺组织病理结构改善,肺泡壁薄;心肌组织病理结构改善,坏死细胞量减少,炎症浸润减轻。（3）对S100A8/A9表达的影响:SM组相较于MI+PM组心肌组织S100A9荧光强度和细胞阳性率下降不显著,但S100A8 mRNA表达显著下调（P＜0.001）,S100A9 mRNA表达下调（P＜0.01）。（4）对心肌组织Ly6g阳性细胞浸润的影响:相较于MI+PM组,SM组心肌组织Ly6g阳性表达细胞率下降（P＜0.001）,荧光强度减弱（P＜0.005）。（5）对S100A8/A9上下游通路相关因子的影响:与MI+PM组相比SM组心肌组织RAGE蛋白水平无显著变化;TLR4 mRNA表达水平上调（P＜0.05）,蛋白表达水平无显著变化;NF-κB p65磷酸化水平降低不显著;SM组心肌组织IL-1β和IL-6水平显著降低（P＜0.001,P＜0.001）;G-CSF水平变化不显著,Ccl2、Cxcl2、Cxc13 水平升高（P＜0.005,P＜0.001,P＜0.001）。（6）在H9c2细胞模型中,相较于NC组,LO+PM组S100A8 mRNA表达有上调趋势,S100A9 mRNA表达上调（P＜0.05）,RAGE表达和NF-κB p65磷酸化水平升高（P＜0.001,P＜0.001）。相较于LO+PM组,SM（2μg/mL）组中S100A8表达水平降低（P＜0.05）,S100A9表达水平则在SM（1μg/mL）组、SM（2 μg/mL）组、SM（4μg/mL）组中均有降低（P＜0.01,P＜0.05,P＜0.001）;RAGE水平变化不显著;SM（1μg/mL）组和 SM（4μg/mL）组NF-κB p65磷酸化水平降低（P＜0.005,P＜0.01）。4.结论1)PM暴露复合心肌缺血小鼠模型中可见缺血心肌组织中S100A8、S100A9表达水平显著增高,中性粒细胞浸润明显,心肌组织炎症因子IL-6、趋化因子Cc12表达升高。体外心肌细胞PM暴露复合糖氧剥夺模型S100A9表达显著上调。S100A8/A9是PM暴露加重心肌缺血损伤的关键分子之一。2)中性粒细胞可能是在PM暴露状态下缺血心肌组织中S100A8/A9表达增高的主要来源,心肌细胞可能部分参与此病理过程。3)生脉饮对S100A8、S100A9表达的调控作用是其减轻PM暴露加重心肌缺血性损伤的途径之一。