论文部分内容阅读
5-甲基胞嘧啶(m5C)作为RNA的一种普遍的修饰近年来得到广泛的关注。越来越多的研究表明,RNAm5C修饰在RNA加工、RNA稳定性、RNA出核转运以及mRNA翻译等过程中起到重要作用。NSUN2(NOP2/Sun domain family,member 2)是哺乳动物RNAm5C甲基转移酶之一,主要负责tRNA和mRNA的甲基化。最近研究表明,NSUN2参与调节生物体的发育及疾病的发生,如细胞增殖、干细胞分化、脑和睾丸发育以及肿瘤发生等。但对NSUN2在生物体发育和疾病发生中的作用和功能及其分子机制仍不甚明了。本研究以肾小管上皮细胞系HEK293和肝癌细胞系HepG2为研究模型,通过CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术敲除NSUN2基因,观察NSUN2敲除后细胞的表型、基因表达和mRNA m5C修饰的变化,进而阐明NSUN2基因及其RNA m5C修饰的生物学功能和作用。1.利用CRISPR/Cas9技术建立RNA m5C甲基转移酶NSUN2基因缺失型HEK293和HepG2细胞系本研究通过CRISPR/Cas9技术介导的同源重组将抗性筛选标记(NeoR和PuroR)及转录终止信号BGH poly(A)整合至NSUN2基因第一外显子上终止NSUN2基因的转录。针对NSUN2基因,设计并筛选出具有高基因编辑效率的gRNA位点。构建出用于沉默NSUN2表达并筛选NSUN2去表达细胞系的Donor载体,NSUN2-PURO-BGH-Donor和NSUN2-NEO-BGH-Donor。通过转染、药物筛选和鉴定等过程,我们最后得到NSUN2基因沉默效率稳定维持在99%和90%的HEK293细胞系及HepG2细胞系,为研究NSUN2基因的功能奠定基础。2.NSUN2基因敲除对HEK293细胞和HepG2细胞表型影响分析本研究旨在了解NSUN2基因敲除对HEK293细胞系和HepG2细胞系生理表型的影响。我们通过绘制细胞生长曲线、细胞划痕实验、Transwell侵袭实验、小管形成实验和流式细胞术等方法检测了 NSUN2基因敲除对HEK293细胞和HepG2细胞增殖、迁移和转移等能力的影响。结果表明,NSUN2基因敲除能显著抑制HEK293细胞和HepG2细胞的增殖和迁移能力,这一抑制作用能通过重新表达NSUN2来恢复。NSUN2基因参与细胞周期进程调控,基因敲除能影响HepG2细胞周期分布,导致G1期细胞减少,S期和G2/M期细胞增多。NSUN2基因还介导肿瘤细胞的转移,NSUN2基因敲除能显著抑制HepG2细胞侵袭能力。此外,我们发现NSUN2基因参与调节肿瘤细胞的血管新生过程,NSUN2基因敲除显著抑制HepG2细胞血管新生能力。3.转录组测序检测NSUN2基因敲除对HEK293细胞系和HepG2细胞系基因表达的影响本研究旨在了解NSUN2基因敲除对细胞基因表达谱的影响。我们通过高通量测序研究NSUN2基因敲除对HEK293细胞和HepG2细胞mRNA的表达谱的影响。结果显示,NSUN2基因敲除后,在HEK293和HepG2细胞中分别筛选到967和2681个差异表达基因。功能分析表明,HEK293细胞差异表达基因通过神经配体-受体互作、蛋白消化和吸收、系统性红斑狼疮、ECM受体互作等信号通路影响细胞黏附、神经系统发育、细胞表面受体信号、细胞分化和细胞增殖等生物过程。HepG2细胞的差异表达基因则与细胞信号转导、迁移、增殖、血管新生、细胞黏附、炎症反应及神经系统发生等生物过程显著相关。其主要富集到Hippo信号通路、癌症通路、神经配体-受体互作、ECM-受体互作、Wnt通路以及MAPK信号通路等。进一步分析表明,ECM-受体互作、TGF-β和PI3K-Akt信号途径可能参与到NSUN2基因敲除介导的细胞增殖和迁移抑制,其中TGFB1、THBS1、CD44、TGFA和LOXL2等基因可能发挥重要作用。我们结果在分子水平上表明NSUN2基因参与调节的生物进程和影响的信号通路。4.RNA甲基转移酶NSUN2基因敲除对HEK293和HepG2细胞m5C修饰影响为了解NSUN2基因介导RNA甲基化的功能,我们通过RNA-BisSeq技术检测分析NSUN2基因敲除对基因RNA甲基化影响。结果显示,在HEK293和HepG2细胞中共检测到4052和2192个差异甲基化位点,分布于1185和707个mRNA中。通过BSP法,我们对测序结果进行验证,并证实了结果的可靠性。对差异甲基化基因功能分析发现,在HEK293细胞中,差异RNA甲基化基因功能主要涉及翻译、mRNA加工、mRNA剪接、mRNA出核转运和mRNA稳定性等,调节的通路包括核糖体、剪接体、RNA转运、癌症蛋白聚糖、焦点粘连、紧密连接以及PI3K-Akt等信号途径。在HepG2细胞中,差异甲基化基因主要参与翻译调节、mRNA代谢、细胞黏附、蛋白折叠、RNA剪接和细胞周期等生物过程。调节通路则主要涉及核糖体、内质网蛋白质加工、剪接体、非酒精性脂肪肝、癌症蛋白聚糖、焦点粘连、紧密连接、PI3K-Akt信号通路和细胞周期等信号途径。综上所述,本研究建立了两个NSUN2基因敲除的细胞系。NSUN2基因敲除能显著抑制细胞增殖和迁移,影响细胞周期,抑制肿瘤细胞血管新生。NSUN2基因敲除导致的差异表达基因功能主要涉及神经系统发育、细胞信号转导、细胞分化、增殖、迁移和血管新生等生物过程,影响神经配体-受体互作、ECM-受体互作、TGF-β和PI3K-Akt等信号途径。NSUN2基因敲除导致的差异RNA甲基化基因则主要涉及转录调节、翻译起始、RNA加工和RNA稳定性等生物过程,调节的通路包括核糖体、剪接体、RNA转运、癌症蛋白聚糖、焦点粘连、紧密连接以及PI3K-Akt等信号途径。