原发性肝癌是世界上第六大常见肿瘤,每年新发的肝癌病例有一半以上发生在我国。目前导致肝癌发病的最主要病因是乙型(HBV)和丙型(HCV)肝炎病毒感染,在我国HBV感染仍是肝癌发病的主因,但目前新的趋势是一些非病毒感染因素例如肥胖、酗酒等所致的肝癌发生率不断提高,尤其在西方国家,这类因素已经成为新增病例逐年增多的主要原因。肝癌起病隐匿,预后差。手术切除和肝移植等被认为是肝癌根治性治疗的手段,但大多数患者在初次诊断时,便已进入肝癌晚期,因而失去了根治性治疗的机会。其中最主要的原因是早期肝癌患者通常无明显症状,或者体积很小,影象学检查较难察觉,而甲胎蛋白(AFP)作为主要的血清标记物,又存在敏感性低的缺点。一些临床指标如肿瘤大小、数目,血管侵犯情况及术前AFP等常与肝癌患者的预后相关,研究表明,生活习惯(吸烟、饮酒和锻炼)、肥胖状态、受教育程度等都可能影响肝癌患者的预后。在肝癌的分子层面进行研究可以深刻理解这些因素如何影响肝癌患者的预后和为肝癌的分子诊断以及术后个体化治疗方案的制定等提供重要的理论依据。microRNA (miRNA)是通常含有22个碱基的短链非编码RNA,通过调控基因表达,可产生包括控制细胞生长、增殖、凋亡、应激等广泛的生物学作用。自本世纪初发现编码miRNA的染色体位置同癌症发生时常发生变异的位置大量重叠后,miRNA与癌症发生、发展的研究开始兴起,目前已有大量的证据证明miRNA在癌症的发生发展中起到了十分重要的作用。同时有研究表明miRNA能抵抗内源性RNA酶的降解从而在血浆中稳定存在。这些重要的研究都提示miRNA可能成为肿瘤诊断的生物标记物和预后干预的靶点。但miRNA由于其调控基因表达的全新模式,使原有的信号转导通路又多了新的一个层次,变得更加复杂。多数miRNA在肿瘤发生发展信号通路中的功能定位尚未明确,在肝癌研究中则更缺乏。结合目前肝癌早期诊断率低和影响肝癌预后的通路中miRNA功能研究不足的现状,本研究通过对正常人群、高危人群(慢性活动性乙肝患者、乙肝后肝硬化患者)、肝癌患者的血浆样本进行芯片分析,筛选出肝癌中差异表达的miRNA,并在独立组中用实时定量PCR进行验证并建立诊断模型,然后用另一个独立组对诊断模型进行验证,找到了一组miRNA联合检测能较好地早期诊断乙肝相关性肝癌。并检测这组miRNA在术前术后的动态变化；另在组织水平观察这组miRNA在癌及癌旁组织中的表达差异及其与患者预后的联系,并结合预后相关的mRNA,初步确定miRNA影响预后的信号通路。第一部分乙肝相关性肝癌与各对照组间差异表达miRNA的筛选及验证本部分的研究旨在寻找在乙肝相关性肝癌患者(HCC)与对照组健康者、慢性活动性乙肝患者及乙肝后肝硬化患者之间差异表达的血浆niRNA并在另一独立组中进行验证,为组建肝癌早期诊断模型奠定基础。研究材料第一组是自2008年8月到2008年12月间在中山医院体检或就诊的符合实验准入标准的健康人、慢性活动性乙肝患者、乙肝后肝硬化患者及乙肝相关性肝癌患者的血浆样本,共计137例：另一组于2009年1月到2009年2月取自中山医院或上海公共卫生中心,实验设计相同,共计102例。提取血浆miRNA后,使用含有723条人类miRNA探针的安捷伦公司人类miRNA芯片V2(Agilent Human MiRNA Microarray kit V2)进行测定,上样量为每个微阵列100微克miRNA。数据标准化后,主要使用非参数方法Mann-Whitney检验分析HCC和healthy、HCC和CHB、HCC和Cirrhosis中miRNA的差异表达。选取差异两倍以上的miRNA,并在新的独立组中(共计样本102例)使用实时定量聚合酶链反应(quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction, qRT-PCR)技术对这些候选miRNA进行验证。结果发现：从芯片结果来看,在HCC和healthy两组间差异表达2倍以上P<0.01,一半以上样本中可检测到的miRNA共有7个；在HCC和CHB两组间差异表达2倍以上,P<10-9,一半以上样本中可检测到的miRNA共有7个；在HCC和Cirrhosis两组间差异表达2倍以上,P<10-9,一半以上样本中可检测到的miRNA共有2个。因miR-122在HCC对比healthy和HCC对比CHB中均有差异表达,因此最后得到15个差异表达miRNA,分别是miR-101, miR-122, miR-122*, miR-181d, miR-192, miR-194, miR-19a, miR-19b, miR-21, miR-223, miR-23b, miR-26a, miR-27a, miR-29c和miR-801。将这15个miRNA在一个新的独立组中使用qRT-PCR进行验证,其中的3个由于在超过20%的样本里到达平台期的循环数超过35次而被排除,剩下12个中有7个miRNA在HCC和总对照组(healthy、CHB及Cirrhosis联合)相比之下具有显著差异(P<0.05)。这7个miRNA分别为miR-122, miR-192, miR-21, miR-223, miR-26a, miR-27a和miR-801.在分析中,我们利用芯片数据和qRT-PCR确定miR-1228表达稳定,可作为内参。我们在血浆里提取了足量的miRNA,分别用microarray技术和qRT-PCR进行了测定。结果表明,血浆中存在稳定表达的miRNA,且在不同生理或病理状态下,部分miRNA在血浆中的表达可发生幅度较大的变化。当HCC和不同对照组相比较时,差异表达的血浆miRNA基本不同(除miR-122在HCC vs healthy和HCC vs CHB都有显著差异外)。第二部分乙肝相关性肝癌早期诊断模型的组建和验证本部分研究旨在对第一部分筛选得到的7个候选miRNA进一步验证并logistic回归模型优化组合各miRNA,建立将乙肝相关性HCC区别于各对照组的诊断模型,并在另一个新的独立组中测试此模型的诊断效能,进一步判断其诊断早晚期肝癌的能力及将其与甲胎蛋白(AFP)在诊断价值方面做了比较。本部分所选的样本准入标准和实验设计与第一部分相同,均来自中山医院或上海公共卫生中心,用于进一步验证7个候选niRNA的样本共计305例,收集时间为2009年3月到2009年8月；用于评价模型诊断效能的样本共计390例,收集时间为2009年9月到2010年6月。在此阶段我们继续用qRT-PCR在305例样本中测试7个候选miRNA和内参的稳定性。在前次验证102例和此次验证305例样本中,得到7个miRNA的表达量后使用logistic回归模型进行优化组合获得将乙肝相关性HCC区别于各对照组的诊断模型。之后用另一个独立组,样本量共计390例,对模型进行评价。评价中,除测试总体诊断肝癌的能力之外,对肝癌Barcelona Clinic Liver Cancer (BCLC)分期中各个期的诊断能力做了细分,并与AFP的诊断效能做了比较。结果发现：经过对305例样本的qRT-PCR验证,结合之前102例样本,共计407样本作为实验的训练集合(Training Set)。在Training set中显示,7个rniRNA中4个表达降低,3个表达升高。在肝癌组表达降低的4个miRNA为miR-122, miR-223, miR-26a和miR-27a,在肝癌和总对照组(healthy, CHB和Cirrhosis联合)中,改变倍数为07(p<0.001),0.3(p=0.0159),0.2(p<0.001),0.3(p<0.001)。3个表达升高的miRNA为miR-192, miR-21和miR-801,在肝癌和总对照组(healthy, CHB和Cirrhosis联合)中,改变倍数为1.4(p<0.001),1.9(p=0.0159),2.0(p<0.0026)。测试单个miRNA区分肝癌和总对照组的诊断能力。我们进一步建立受试者工作特征曲线(Receiver Operating Characteristic Curve, ROC曲线),并通过计算ROC曲线下面积(Area Under Curve, AUC)来判断每一个miRNA的诊断能力。得到rniR-122, miR-223, miR-26a, miR-27a, miR-192, miR-21, miR-801的AUC值分别为0.553,0.643,0.665,0.638,0.569,0.626,0.629。为优化诊断效能,我们利用Training set(407例样本)对上述7个miRNA进行逐步logistic回归,建立诊断方程logit (p=HCC)=-1.424-O.292×miR-122+0.4511×miR-192+O.6112×miR.21-0.1796×miR223-0.2487×miR-26a-0.3542×miR-27a+0.209×miR-801。同样我们用ROC曲线的曲线下面积判断其诊断效能,其区分肝癌和对照组的AUC为0.864。之后,我们利用另一个新的独立组(共计390例样本,设计与前相同)作为验证集(Validation Set),对诊断模型进行验证。在Validation set中,模型区分肝癌和总对照组的AUC为0.888(95%可信区间,0.852to0.917；敏感度81.8%,特异度83.5%)。对于区分BCLC分期0期,A期,B期,C期的肝癌和对照组的AUC分别为0.888,0.888,0.901和0.881。另我们将肝癌患者分成AFP<400ng／ml和AFP≥400ng／ml两组,模型对区分前者和总对照组的AUC为0.879,后者则为0.910。另我们对模型区分HCC和healthy,HCC和CHB,HCC和Cirrhosis分别分析,AUC分别为0.941,0.842,0.884。同时我们总结两个验证组,共计134例healthy,147例CHB,116例Cirrhosis及400例,内参miR-1228的表达在四组qRT-PCR的CT平均值均为28,变异系数分别为4.5%,4.5%,3.6%,5.4%。大规模的验证表明,7个候选miRNA在血浆中均有表达,且在各组差异表达,具备了成为诊断标记物的基础。观察单个miRNA区分肝癌和总对照组的能力,其AUC面积较低,尚不能很好地诊断肝癌。用logistics回归构建的诊断模型,经大样本量验证后证实,不仅能十分高效的将肝癌和总对照组区分开来,且对于早期肝癌的诊断能力亦很高。在AFP阴性患者,诊断模型的同样保持很高的准确性。另外,通过大样本量qRT-PCR对miR-1228的验证,证实其作为内参十分稳定可靠。第三部分诊断模型中miRNA术前术后的动态变化及其对预后的价值评价本部分研究旨在探索诊断模型中的miRNA在肝癌患者术前术后的动态变化及其监测治疗效果的评价,并对内参niR-1228术前术后稳定性进行评价。我们收集了前述乙肝相关性肝癌组中54例患者术后的血浆,按相同标准提取血浆miRNA,比较术后7个miRNA表达量的改变,同时使用逐步logistic回归优化组合能区别术前术后的miRNA,初步建立监测治疗的miRNA模型,并用ROC曲线进行效能评价。同时比较术前术后qRT-PCR中miR-1228的读数变化,确定其稳定性。结果发现：7个miRNA其中2个miR-122和miR-801表达量术前术后变化不显著,其余5个有2个miR-21和miR-192表达量术后明显下降(平均CT变化0.77,p=0.03；1.74,p<0.001)；有3个miR-223, miR-26a, miR-27a术后显著升高(平均CT变化-0.61,p=0.03；-0.81,p=0.06和-0.55,p=0.06)。用逐步logistic回归建立模型Logit(p)=-0.138-0.6067×miR-192-0.5216×miR-21+0.6116×miR-223,用ROC曲线判断其诊断效能,其AUC为0.852。另外,qRT-PCR实验测得内参niR-1228的平均CT值仍为28,变异系数5.6%。结果表明：在由7个miRNA组成的肝癌诊断模型中,有5个miRNA在术前术后发生显著改变,对手术治疗较敏感。用逐步logistic回归可利用3个miRNA建立监测手术治疗的模型,初步评价来看监测效能较理想,但需进一步验证并结合预后资料进一步确定其预后价值。内参niR-1228术后表达仍然稳定,与术前各组相比表达量几乎相同,作为内参十分可靠。第四部分诊断模型中miRNA在肝癌及癌旁组织中的表达及其影响预后的信号通路初探本部分研究旨在探索诊断模型中7个血浆miRNA在肝癌和癌旁组织中的表达情况,及其与肝癌预后的关系。同时利用基因芯片确定所有与miRNA表达差异相关的基因,利用Ingenuity Pathway Analysis (IPA)分析存在的通路,从而推测miRNA可能的作用靶点。本研究利用既往已完成的microRNA芯片(由俄亥俄州立大学癌症中心(Comprehensive Cancer Center at the Ohio State University)制作)在组织中对7个血浆miRNAs验证。并结合基因芯片(Affymetrix GeneChip HG-U133A2.0arrays)分析基因表达与miRNA的关系。其中肝癌样本microRNA芯片共252张,癌旁样本nicroRNA芯片共252例；肝癌样本基因芯片238张,癌旁样本基因芯片249张,microRNA芯片和基因芯片的上样样本绝大多数重叠,均来自2002年到2003年就诊于我所的肝癌患者,拥有完整临床信息和近十年随访信息。6个血浆：niRNAs在组织中验证发现miR-21和miR27a在肝癌组织中高表达,miR-192、miR-122、miR-26a和miR-223在肝癌组织中低表达。miR-801在microRNA芯片中未包括。分析癌和癌旁miRNAs与预后关系时发现,在肝癌组织中miR-21、miR-223与患者术后总体生存率相关,rniR-192与患者术后无瘤生存率相关；在癌旁组织中,发现miR-21、miR-223、miR-26a与患者总体生存率相关,miR-21和miR-223与患者术后无瘤生存率相关。为初步探讨肝癌miR-192影响肝癌预后的通路,我们将患者分成miR-192高表达和低表达两组,通过基因芯片数据分析两组患者差异表达基因1304个,利用IPA分析这些基因主要参与的信号通路以实现对miRNA功能的定位。结果表明：在组织中对7个血浆1niRNAs的验证显示,所有miRNAs在癌和癌旁组织中均有差异表达,其中miR-21和miR27a在肝癌中表达上调,结合以往文献,符合其致癌miRNA (Oncomir)的特点；miR-192、miR-122、miR-26a和miR-223在肝癌中表达下调,结合文献,符合其肿瘤抑制miRNA的特点。在预后分析中,发现癌和癌旁某些miRNA的差异表达都与术后总体生存或无瘤生存相关。提示miRNA在肿瘤特性引起的与肝脏微环境引起的预后差异中,均伴有重要角色。miR-192在肿瘤中的表达与术后无瘤生存相关,我们找到与其表达相关的基因后进行通路分析,发现大多数差异基因在信号通路中的聚集点为NF-κB, Erkl/2、JNK和histone h4,提示这些可能是miR-192的调控位点。结论1.人类血浆中存在稳定表达的miRNA,且这类rniRNA中有些在机体状态不同(如疾病等)时表达发生显著变化,可作为潜在的分子诊断标记物。2.通过大样本量的高通量miRNA芯片筛选及大样本量的qRT-PCR验证,我们建立了一个基于血浆miRNA表达量的诊断模型,可将肝癌从健康组,慢性活动性乙肝组,肝炎后肝硬化组中区分开来,且对早期或中晚期肝癌诊断均十分高效、稳定。对于AFP阴性肝癌患者同样具有很高的诊断准确率。3.通过大样本量的健康组、慢性活动性乙肝组、肝炎后肝硬化组、乙肝相关性肝癌组及肝癌手术后切除组患者血浆的qRT-PCR测定,明确：niR-1228表达非常稳定,在血浆miRNA研究中可作为十分可靠的内参。4.在7个血浆miRNA中,多数在肝癌和癌旁组织中差异表达,并有miRNA与肝癌的转移复发和总体生存率相关。通过与预后相关的表达谱分析及miRNA的功能定位,发现miRNA在一些主要通路中承担重要角色。潜在应用价值1.含有7个miRNA的组合可在临床上作为肝癌诊断尤其是早期诊断的分子诊断工具。2.对7个miRNA中已明确在肝癌预后中承担重要作用者可进行实验干预,以改变肝癌的预后。创新点1.通过大样本规范的实验设计,首次从临床应用的角度,证实血浆niRNA在肝癌诊断尤其是早期诊断中具有十分重要的价值。2.首次发现血浆miR-1228在不同生理或病理状态下(健康组,慢性活动性乙肝组,肝炎后肝硬化,乙肝相关性肝癌,肝癌术后)稳定表达,作为内参,十分可靠。3.将血浆miRNA与其组织表达联系起来,并探索其与肝癌预后的关系,从而进一步解析miRNA在信号通路中的重要作用。