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目的:芳香烃受体核转位因子(The aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator,ARNT)也叫作缺氧诱导因子-1β(hypoxia-inducible factor-1β,HIF-1β),是芳香烃受体(The aryl hydrocarbon receptor,AhR)信号通路和缺氧诱导因子-1(The hypoxia-inducible factor-1,HIF-1)信号通路的共同成分,能够介导两条信号通路对外界环境的反应,诱导下游靶基因的表达并产生一系列生理生化反应。AhR信号通路是调节机体对外源性有害化学物质代谢的重要分子机制,而HIF-1信号通路是在许多病理状态下机体调节适应低氧微环境的关键途径,但目前关于两条信号通路到底是以何种方式相互作用还具有争议性。既往研究普遍认为,ARNT在细胞中的表达恒定。然而,近期有若干研究指出ARNT在缺氧环境的表达量呈现组织特异性,并随着氧浓度的变化表达量存在差异。这可能提示了AhR和HIF-1信号通路之间复杂关系的潜在原因。目前关于缺氧等环境下ARNT在肺癌A549细胞中的表达,还未见文献报道。本研究拟探讨在不同缺氧程度以及不同浓度B(a)P处理下,肺癌A549细胞中ARNT表达量的变化情况,以期为这两条信号通路之间关系的研究提供一定的参考。 方法:采用RT-PCR法扩增目的基因ARNT片段,构建带有红色荧光标签的ARNT基因真核表达载体(pDsRed-Monomer-N1-ARNT系统);采用脂质体转染技术介导重组质粒在A549细胞中的表达;在不同氧浓度(20%,15%,10%,5%,2%O2,作用3h)条件下分别培养pDsRed-Monomer-N1-ARNT转染细胞系和正常A549细胞系,建立不同程度的缺氧状态。运用高内涵细胞筛选系统的荧光呈像模块,观察转染细胞系中ARNT基因红色荧光融合蛋白的荧光强度变化情况。运用Western Blot检查正常A549细胞经缺氧处理后ARNT的表达情况;采用不同浓度的B(a)P(0μM、2μM、4μM及8μM,作用24h)处理pDsRed-Monomer-N1-ARNT转染细胞系和正常A549细胞,运用相同方法分别观察转染细胞系ARNT基因红色荧光融合蛋白的荧光强度变化情况和正常A549细胞经处理后ARNT的表达情况; 结果:pDsRed-Monomer-N1-ARNT重组质粒大小为7.0kb,经酶切鉴定和DNA序列测定证明载体构建正确,转染细胞后pDsRed-Monomer-N1-ARNT重组质粒在A549细胞中成功表达;用不同缺氧程度分别处理pDsRed-Monomer-N1-ARNT转染细胞系后,ARNT融合蛋白的荧光强度增加,差异具有显著性(P<0.05)。用相同氧气浓度处理正常A549细胞后,Western Blot结果显示ARNT的表达量为1:1.2:1.8:3:5,表达量显著增加(P<0.05)。用不同浓度B(a)P处理pDsRed-Monomer-N1-ARNT转染细胞系后,ARNT融合蛋白的荧光强度没有明显变化,差异不具有显著性(P>0.050)。用相同浓度梯度B(a)P处理正常A549细胞后,Western Blot结果显示ARNT的表达量为1:1.3:1.1:1.2,没有显著性差异(P>0.05); 结论:ARNT在A549细胞中的表达随着缺氧程度的增高,表达量增加;ARNT在A549细胞中的表达量不受不同浓度B(a)P暴露的影响。