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土壤盐渍化严重影响农作物的生长和产量,是限制农业生产的主要因素之一。我国是世界盐碱地大国之一,盐碱地分布广泛,面积约0.346亿hm2。因此,如何利用和开发这些盐碱地资源,提高作物产量已成为迫切需要解决的问题。目前,通过生物技术方法分离植物耐盐基因并在转基因植物中表达,培育耐盐作物新品种,已经成为改良土壤盐碱地的有效手段。超氧化物歧化酶(SOD)是一种广泛存在于动植物、微生物中的金属酶,是机体内活性氧清除系统中的重要抗氧化酶类。研究发现,植物体内SOD酶活性的高低和植物的抗逆性密切相关,而且过表达SOD基因能明显提高植物对盐胁迫的抵御能力。本论文选取碱蓬、盐角草和盐芥三种盐生植物为材料,采用RACE技术分别克隆出碱蓬和盐角草Mn-SOD、Cu/Zn-SOD基因,并进行序列分析;构建原核表达载体,并在大肠杆菌中表达;将重组菌在不同NaCl浓度的液体LB培养基中诱导表达,通过测定OD600值来分析5个SOD基因的耐盐功能。研究结果如下:1.通过简并引物扩增和RACE技术,分别克隆出碱蓬和盐角草Mn-SOD、Cu/Zn-SOD基因。碱蓬Mn-SOD(GenBank注册号:JQ061157)全长为1050bp,开放阅读框长699bp,推测编码233个氨基酸,分子量约为25.9KDa,其氨基酸序列与陆地棉、橡胶树的序列相似性为84%。转运肽和亚细胞定位分析表明其可能为线粒体SOD基因。碱蓬Cu/Zn-SOD基因(GenBank注册号:JQ061159)全长为843bp,开放阅读框为459bp,推测编码153个氨基酸,分子量约为15.1KDa。其蛋白序列与菠菜Cu/Zn-SOD序列相似性高达94%,与冰叶日中花细胞质Cu/Zn-SOD蛋白序列相似性为92%。盐角草Mn-SOD基因(GenBank注册号:JQ061158)全长为1053bp,开放阅读框长699bp,推测编码233个氨基酸,分子量约为25.7KDa。其氨基酸序列与陆地棉的序列相似性为83%,与紫杆柳的序列相似性为81%。转运肽和亚细胞定位分析表明其可能为线粒体SOD基因。盐角草Cu/Zn-SOD基因(GenBank注册号:JQ061160)全长为985bp,开放阅读框为684bp,推测编码228个氨基酸,分子量约为23.2KDa,蛋白序列与菠菜Cu/Zn-SOD序列相似性达81%。转运肽分析表明其可能为叶绿体SOD基因。2.根据获得的碱蓬、盐角草SOD基因和盐芥Mn-SOD基因(EF140719)序列设计引物扩增编码区,并在引物上引入NdeI和EcoRV酶切位点。构建原核表达载体pET30a/SsCSD、pET30a/SsMSD、pET30a/SeCSD、pET30a/SeMSD和pET30a/ThMSD,并转化大肠杆菌E.coliBL21(DE)进行诱导表达。经SDS-PAGE电泳检测发现蛋白条带大小与预期一致,目的蛋白均成功表达。3.考虑到高浓度IPTG会对重组菌生长产生抑制作用,我们对IPTG浓度进行优化,以确保SOD基因既能够表达,又不影响重组菌的生长状况。通过实验我们选取0.025mM为IPTG的最佳浓度。将初始量相同的重组菌接种到6.5%,7%,7.5%,8%NaCl浓度的液体LB培养基(50mg·L-1Kan,0.025mMIPTG)中培养,测定OD600值。结果发现重组菌BL21(pET30a/SsMSD)、BL21(pET30a/SeMSD)和BL21(pET30a/ThMSD)表现出明显的生长优势,说明碱蓬、盐角草和盐芥SOD基因在植物耐盐方面可能具有重要作用。