目的小鼠胚胎干细胞（Mouse embryonic stem cells,mESCs）是从植入前的小鼠囊胚的内细胞团分离,再经过特殊条件的体外培养而获得的一种具有自我更新能力和分化功能的一类细胞,是研究表观遗传学、发育生物学、基因以及蛋白组学等多个方向的优秀研究模型。EIF3是真核生物起始翻译因子之一,是一个多亚基复合体,其亚基包括eIF3a、eIF3b、eIF3c和eIF3d等十三个亚基,其中eIF3d是一个RNA结合蛋白,是EIF翻译因子的重要组成部分。目前为止,eIF3d的相关研究较少,主要集中于癌症发生方面的研究,已发现eIF3d在调控细胞周期、细胞增殖以及细胞代谢应激等方面的功能作用。而本课题组之前研究发现一些RNA结合蛋白在小鼠精原干细胞中大量表达,经过mESCs的突变筛选,发现了eIF3d这个翻译因子异常表达,因此,为了研究eIF3d在小鼠胚胎干细胞中的功能,本课题构建了eIF3d突变的小鼠胚胎干细胞模型。除此之外,为了进一步研究精子发育和精子功能的分子机制,结合本课题组此前的研究发现PKA信号通路在小鼠减数分裂后生精细胞中的功能作用与PKA调节亚基RIα相互作用的蛋白有潜在的联系,利用酵母双杂交系统筛选出与RIα相互作用的蛋白。因此,为进一步研究蛋白的相互作用,还构建了Vadc2、Morn2、Rps15a、Mettl16、Mena这五个基因的蛋白表达载体。方法1.lenti CRISPR v2载体的构建:为了研究eIF3d在小鼠胚胎干细胞中的功能与机制,本课题设计了一些靶向eIF3d的CDS序列的sg RNAs,将这些sg RNA连接到lenti CRISPR v2载体上,构建sg RNA-lenti CRISPR v2慢病毒转染载体。2.慢病毒包装与病毒量检测:将构建的慢病毒转染载体用293T细胞进行慢病毒包装,提取及纯化包装慢病毒后,进行MOI检测慢病毒的浓度。3.细胞转染:将得到的慢病毒用来转染小鼠胚胎干细胞,构建了eIF3d突变的胚胎干细胞模型,最后对筛选得到的突变细胞进行鉴定分析。4.RIα相互作用蛋白表达载体的构建:通过PCR将Vadc2、Morn2、Rps15a、Mettl16、Mena这五个基因的c DNA扩增并连接到表达载体上。结果本课题中,为构建lenti CRISPR v2载体,将设计的sg RNA成功连接到lenti CRISPR v2载体上,利用293T细胞将载体进行慢病毒包装,再进行MOI检测之后,得到了慢病毒的最佳转染量,之后再进行mESCs的转染,转染后经过嘌呤霉素的筛选,成功筛选到了转染成功的细胞,将这些细胞进行基因组提取、PCR扩增以及测序分析,最终成功得到了三个eIF3d有效突变的细胞样本。而在蛋白相互作用的研究方法中,经过连接与单克隆筛选,成功将Vadc2、Morn2、Rps15a、Mettl16、Mena这五个基因连接到带His标签的蛋白表达载体上。结论1.利用CRISPR-cas9技术成功构建出的eIF3d突变细胞系,为进一步研究eIF3d在小鼠胚胎干细胞中的作用以及其分子机制提供了实用的实验基础以及提供了一定的理论依据,这些研究将会有助于未来的研究人员研发出更加有效更加经济低毒的肿瘤治疗靶向药物。2.本课题构建了与RIα相互作用蛋白的表达载体,构建的载体将用于此课题后续的GST-pull dowm实验,进而解析PKA信号通路。