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丙酮酸是重要的代谢节点,对丙酮酸代谢通量的研究多集中在模式菌大肠杆菌(Escherichia coli)中,一般认为丙酮酸脱氢酶系(PDHC)在好氧生长下起作用,而丙酮酸-甲酸裂解酶(PFL)在厌氧发酵中起作用,近几年发现PDHC在厌氧下也有一定的功能,但是克雷伯氏肺炎杆菌(Klebsiella pneumoniae)中的丙酮酸-乙酰辅酶A代谢途径却很少有人研究,因此对于高产1,3-PD的优势菌株K.pneumoniae来说,非常有必要研究一下丙酮酸节点方面的碳流代谢机制。 本课题借助Red同源重组技术,对丙酮酸分解的两条代谢途径的相关基因进行敲除,获得PDHC缺失菌株KG-PD和PFL缺失菌株KG-PF,在以甘油为底物的培养基中进行摇瓶培养,发现KG-PD在好氧和厌氧下的生长都遭到了严重的抑制,且好氧条件下抑制更为严重,分析亲本菌KG2的相关酶活,结果显示好氧条件下PDHC的酶活性是PFL的4倍,说明在好氧条件下,丙酮酸-乙酰辅酶A的代谢主要依赖于PDHC。厌氧下PDHC的酶活性仅为PFL的一半,但是KG-PD突变株的生长抑制比KG-PF的更为严重,同时结合对突变株中CO2水平和氧化还原水平的分析,发现厌氧条件下PDHC主要是为菌体生长提供还原能NADH,进一步敲除CO2再生途径FDH后菌体会表现出CO2不足的症状。PFL缺失菌株在好氧和厌氧条件下1,3-PD的产量都有所提高,因此KG-PF可作为高产1,3-PD的潜在优势菌株。在KG-PD突变株的基础上进一步敲除甲酸脱氢酶(FDH-N)基因,菌株在好氧条件下生长抑制的现象得到了纠正,恢复了很好的生长,还表现出良好的乙偶姻高产潜能。