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急性肾损伤（acutekidney injury，AKI）是临床上常见危急重症，目前尚无有效治疗方法，其致病因素有多种，从肾损伤的方式上主要分为缺血再灌损伤（ischemia-reperfusion injury，I/R）和肾毒性物质（主要由毒性药物、横纹肌溶解等）损伤。Claudia Schwarzenberger的研究报道，在刀豆球蛋白/抗刀豆球蛋白抗体所致小鼠肾小球内皮细胞损伤中，去除血小板或使用血小板抑制药氯吡格雷可减轻肾损伤。在肾小球疾病中，血小板分泌的活性物质（促炎性介质、生长因子等）改变肾小球基底膜通透性，导致免疫复合物沉积而破坏肾脏结构和功能。亦有Takaharu Tanaka的研究报道，人血小板通过刺激系膜细胞产生单核细胞趋化蛋白-1（monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1）而加重肾小球损伤，此过程与 CD40/CD40L通路相关。但血小板及其自身受体表达变化在急性肾损伤中的作用和具体机制目前尚不清楚。本课题采用缺血再灌致急性肾损伤（ischemia-reperfusion-induced acute kidney injury,I/R AKI）大鼠模型和横纹肌溶解致急性肾损伤（rhabdomyolysis-induced acute kidney injury,RM-AKI）小鼠模型研究血小板及其表面受体在不同病因诱导急性肾损伤中的作用及其机制，为防治急性肾损伤提供新的策略。
第一部分 血小板在缺血再灌致急性肾损伤中的作用研究
目的：缺血再灌损伤引起凝血系统激活和炎症反应，导致肾小管上皮细胞（tubular epithelial cell，TECs）坏死，是导致AKI的常见原因。血小板在凝血和炎症中起到重要的作用，然而缺血再灌损伤过程中血小板的活化机制及活化的血小板和肾损伤之间的相互关系尚未明确。通过I/R AKI大鼠模型实验及体外肾小管上皮细胞实验探讨血小板在I/R AKI中的作用。
方法：夹闭左侧肾蒂60min后恢复血流灌注制备I/R AKI大鼠模型，造模48 h后取血和肾脏。使用血小板聚集仪检测血小板聚集、释放功能；免疫蛋白印迹检测血小板膜受体GPⅥ、P2Y12和αIIb的表达；生化试剂盒检测肾功能指标血清肌酐（serum creatinine，Cr）和尿素氮（bloodurea nitrogen，BUN）；以及肾组织HE染色观察肾损伤情况。用I/R AKI大鼠贫血小板血浆（platelet-poor plasma，PPP）孵育假手术组大鼠洗涤血小板，检测血小板聚集功能。体外培养人肾小管上皮细胞（human renal tubular epithelial cell line，HK-2）和大鼠肾小管上皮细胞（rat renal proximal tubular epithelial cell，NRK），分别缺氧9h和12h，均复氧2h模拟缺血再灌损伤，检测细胞上清对血小板聚集、释放功能的影响；用激活血小板的上清与缺氧处理的TECs复氧共培养2 h，CCK-8试剂盒检测细胞活性。
结果：I/R AKI大鼠的血小板聚集、释放功能明显高于假手术组，其PPP可增强假手术组大鼠洗涤血小板的聚集功能；缺氧复氧（hypoxia-reoxygenation， H/R）处理TECs的培养上清可增强正常血小板的聚集功能；正常血小板的激活上清可促进缺氧复氧处理的TECs凋亡；I/R AKI大鼠血小板膜受体GPVI、P2Y12、αIIb表达无变化。
结论：I/R AKI大鼠血小板活性明显增强，而膜受体GPVI、P2Y12、αIIb表达无变化；肾小管上皮细胞损伤后释放的物质可活化血小板，血小板激活后释放物质反作用于肾小管上皮细胞，加重肾小管上皮细胞损伤，两者形成“肾小管上皮细胞损伤-血小板激活”的恶性循环。
第二部分 血小板GPVI在横纹肌溶解致急性肾损伤中的作用及其机制研究
目的：横纹肌溶解导致肌细胞损伤并释放大量胞内物质，尤其是血红素（heme）进入血液，是引起急性肾损伤的一个重要因素。但在RM-AKI中heme与血小板的关系尚未有研究报道，而且血小板及其受体在 AKI中的具体作用及机制尚不清楚。通过探究血小板在 RM-AKI中被活化原因及其自身受体表达变化情况，揭示其在该疾病中的作用及机制。
方法：给予小鼠双下肢肌肉注射50%甘油（10 mL/kg）制备RM-AKI小鼠模型，48 h后麻醉，下腔静脉取血，并取肾组织。给予小鼠尾静脉注射JAQ1（2μg/g）在体阻断血小板GPVI，对照组给予同等剂量IgG2a，于第4天给予50%甘油（5 mL/kg）双下肢肌肉注射制备RM-AKI模型，24 h后采集血样和肾组织。不同浓度的heme（50、100μM）分别孵育血小板30 min及人巨核细胞Meg-0124 h，检测血小板聚集、释放功能及血小板和Meg-01细胞相关蛋白表达。静息血小板、凝血酶(0.2 U/mL)激活的血小板和预先孵育JAQ1（20μg/mL）5min再被凝血酶激活的血小板分别孵育小鼠巨噬细胞3 h，诱导METs形成。生化试剂盒检测小鼠BUN和Cr；HE染色观察肾组织病理变化；免疫组化技术检测肾组织血小板浸润；荧光免疫法检测肾组织及体外诱导形成的METs；血小板聚集仪检测血小板聚集、释放功能实验；流式细胞仪检测血小板 P-selectin、JON/A及GPVI表达；斑块回缩实验反映血小板功能活性；Western blot检测血小板及Meg-01细胞GPVI、P2Y12、αIIb蛋白表达。
结果: RM-AKI小鼠血小板聚集、释放和斑块回缩水平均高于对照组，且GPVI表达显著增加，而P2Y12、αIIb表达无变化；heme引起血小板P-selectin， JON/A和GPVI表达增加，并直接诱导血小板聚集和释放，而阻断GPVI可阻断heme诱导的血小板聚集；Western blot结果显示heme可增强GPVI下游信号通路中磷脂酶Cγ2（phospholipase Cγ2，PLCγ2），Syk磷酸化，增加血小板GPVI表达，不影响血小板P2Y12、αIIb表达，亦不影响Meg-01细胞GPVI、P2Y12、αIIb表达；给予JAQ1在体阻断血小板GPVI的 RM-AKI小鼠METs形成显著减少，肾损伤程度明显减轻；体外阻断血小板GPVI，可减少活化血小板诱导METs形成。
结论： RM-AKI小鼠血小板活性增强，GPVI表达增加；heme通过 GPVI激活血小板，直接诱导血小板聚集并特异性增加血小板GPVI表达；阻断血小板GPVI可减少 METs形成，减轻小鼠肾损伤。因此，血小板 GPVI可作为治疗RM-AKI的潜在治疗靶点。
第一部分 血小板在缺血再灌致急性肾损伤中的作用研究
目的：缺血再灌损伤引起凝血系统激活和炎症反应，导致肾小管上皮细胞（tubular epithelial cell，TECs）坏死，是导致AKI的常见原因。血小板在凝血和炎症中起到重要的作用，然而缺血再灌损伤过程中血小板的活化机制及活化的血小板和肾损伤之间的相互关系尚未明确。通过I/R AKI大鼠模型实验及体外肾小管上皮细胞实验探讨血小板在I/R AKI中的作用。
方法：夹闭左侧肾蒂60min后恢复血流灌注制备I/R AKI大鼠模型，造模48 h后取血和肾脏。使用血小板聚集仪检测血小板聚集、释放功能；免疫蛋白印迹检测血小板膜受体GPⅥ、P2Y12和αIIb的表达；生化试剂盒检测肾功能指标血清肌酐（serum creatinine，Cr）和尿素氮（bloodurea nitrogen，BUN）；以及肾组织HE染色观察肾损伤情况。用I/R AKI大鼠贫血小板血浆（platelet-poor plasma，PPP）孵育假手术组大鼠洗涤血小板，检测血小板聚集功能。体外培养人肾小管上皮细胞（human renal tubular epithelial cell line，HK-2）和大鼠肾小管上皮细胞（rat renal proximal tubular epithelial cell，NRK），分别缺氧9h和12h，均复氧2h模拟缺血再灌损伤，检测细胞上清对血小板聚集、释放功能的影响；用激活血小板的上清与缺氧处理的TECs复氧共培养2 h，CCK-8试剂盒检测细胞活性。
结果：I/R AKI大鼠的血小板聚集、释放功能明显高于假手术组，其PPP可增强假手术组大鼠洗涤血小板的聚集功能；缺氧复氧（hypoxia-reoxygenation， H/R）处理TECs的培养上清可增强正常血小板的聚集功能；正常血小板的激活上清可促进缺氧复氧处理的TECs凋亡；I/R AKI大鼠血小板膜受体GPVI、P2Y12、αIIb表达无变化。
结论：I/R AKI大鼠血小板活性明显增强，而膜受体GPVI、P2Y12、αIIb表达无变化；肾小管上皮细胞损伤后释放的物质可活化血小板，血小板激活后释放物质反作用于肾小管上皮细胞，加重肾小管上皮细胞损伤，两者形成“肾小管上皮细胞损伤-血小板激活”的恶性循环。
第二部分 血小板GPVI在横纹肌溶解致急性肾损伤中的作用及其机制研究
目的：横纹肌溶解导致肌细胞损伤并释放大量胞内物质，尤其是血红素（heme）进入血液，是引起急性肾损伤的一个重要因素。但在RM-AKI中heme与血小板的关系尚未有研究报道，而且血小板及其受体在 AKI中的具体作用及机制尚不清楚。通过探究血小板在 RM-AKI中被活化原因及其自身受体表达变化情况，揭示其在该疾病中的作用及机制。
方法：给予小鼠双下肢肌肉注射50%甘油（10 mL/kg）制备RM-AKI小鼠模型，48 h后麻醉，下腔静脉取血，并取肾组织。给予小鼠尾静脉注射JAQ1（2μg/g）在体阻断血小板GPVI，对照组给予同等剂量IgG2a，于第4天给予50%甘油（5 mL/kg）双下肢肌肉注射制备RM-AKI模型，24 h后采集血样和肾组织。不同浓度的heme（50、100μM）分别孵育血小板30 min及人巨核细胞Meg-0124 h，检测血小板聚集、释放功能及血小板和Meg-01细胞相关蛋白表达。静息血小板、凝血酶(0.2 U/mL)激活的血小板和预先孵育JAQ1（20μg/mL）5min再被凝血酶激活的血小板分别孵育小鼠巨噬细胞3 h，诱导METs形成。生化试剂盒检测小鼠BUN和Cr；HE染色观察肾组织病理变化；免疫组化技术检测肾组织血小板浸润；荧光免疫法检测肾组织及体外诱导形成的METs；血小板聚集仪检测血小板聚集、释放功能实验；流式细胞仪检测血小板 P-selectin、JON/A及GPVI表达；斑块回缩实验反映血小板功能活性；Western blot检测血小板及Meg-01细胞GPVI、P2Y12、αIIb蛋白表达。
结果: RM-AKI小鼠血小板聚集、释放和斑块回缩水平均高于对照组，且GPVI表达显著增加，而P2Y12、αIIb表达无变化；heme引起血小板P-selectin， JON/A和GPVI表达增加，并直接诱导血小板聚集和释放，而阻断GPVI可阻断heme诱导的血小板聚集；Western blot结果显示heme可增强GPVI下游信号通路中磷脂酶Cγ2（phospholipase Cγ2，PLCγ2），Syk磷酸化，增加血小板GPVI表达，不影响血小板P2Y12、αIIb表达，亦不影响Meg-01细胞GPVI、P2Y12、αIIb表达；给予JAQ1在体阻断血小板GPVI的 RM-AKI小鼠METs形成显著减少，肾损伤程度明显减轻；体外阻断血小板GPVI，可减少活化血小板诱导METs形成。
结论： RM-AKI小鼠血小板活性增强，GPVI表达增加；heme通过 GPVI激活血小板，直接诱导血小板聚集并特异性增加血小板GPVI表达；阻断血小板GPVI可减少 METs形成，减轻小鼠肾损伤。因此，血小板 GPVI可作为治疗RM-AKI的潜在治疗靶点。