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溃疡性结肠炎(Ulcerative Colitis，UC)是一种慢性非特异性炎症性肠病，部分溃疡性结肠炎患者疾病反复发作到最后可发展为结肠癌[1]。近年来，UC的发病率正处于上升期。传统认为UC的高发地区是欧洲和北美，但近年来亚洲UC发病率明显增加，尤其是我国，UC的发病率在10年间增加了3.08倍[2]。其主要临床表现为腹痛、腹泻、黏液血便等，或伴有体重减轻、呕吐等症状[3]。目前，临床上治疗溃疡性结肠炎的手段包括药物治疗和手术治疗，药物治疗有糖皮质激素类、氨基水杨酸类、中药制剂和免疫抑制剂等[4]。但这些药物效果不尽如人意，溃疡性结肠炎的治疗仍是困扰临床医生的难点之一[5]。尽管首次报道UC至今已有160多年，当前的研究报道UC的发生与免疫功能紊乱、肠道菌群失调、遗传、环境等等均密切相关，但其病因和具体发病机制目前仍不完全清楚[6]。因此探究溃疡性结肠炎急性发作后的病理生理变化，寻找新的药物治疗靶点对于UC的防治具有重要意义。
山莨菪碱(Anisodamine，ANI)是我国科学家从茄科植物唐古特莨菪中提取出来的一种生物碱，是毒蕈碱乙酰胆碱受体阻断剂，新斯的明(neostigmine，NEO)是一种胆碱酯酶抑制剂。在本课题组前期研究发现把山莨菪碱和新斯的明以500:1组成复方，可以一方面通过山莨菪碱阻断M受体，另一方面通过新斯的明抑制胆碱酯酶的活性，减少ACh的水解，两方面协同地增加ACh的浓度，进而激活?7nAChR发挥抗炎作用。除此之外，我们在LPS诱导的脓毒症小鼠模型[7]、小鼠类风湿性关节炎[8]和大鼠挤压综合征[9]等动物模型上均发现山莨菪碱和新斯的明联合应用能产生有意义的治疗作用。然而，山莨菪碱和新斯的明联合应用在溃疡性结肠炎急性发作中是否具有作用及机制并不清楚。
因此，本课题对山莨菪碱和新斯的明联合治疗溃疡性结肠炎急性发作的作用及机制进行研究，主要分成三部分：第一部分中，探究山莨菪碱和新斯的明联合治疗溃疡性结肠炎急性发作的作用；第二部分中，探究山莨菪碱和新斯的明联合治疗溃疡性结肠炎急性发作的具体机制。第三部分中，对山莨菪碱和新斯的明联合治疗溃疡性结肠炎急性发作的靶点进行验证。
(一)山莨菪碱和新斯的明联合治疗对溃疡性结肠炎急性发作具有保护作用
(1)山莨菪碱、新斯的明分别单独使用以及山莨菪碱和新斯的明联合使用对溃疡性结肠炎急性发作的作用研究
我们将C57BL/6小鼠分成5组：CON组、DSS组、DSS+ANI(20 mg/kg，i.p.)组、DSS+NEO(40μg/kg，i.p.)组、DSS+ANI(10 mg/kg，i.p.)+NEO(20μg/kg，i.p.)组；CON组小鼠正常饮水，其余四组喂3%的DSS水溶液连续7天，制备溃疡性结肠炎急性发作模型，分别观察造模过程中动物体重变化和粪便状态、疾病活动指数、造模后地结肠长度变化、结肠壁组织病理变化。
实验结果如下：山莨菪碱单独使用以及山莨菪碱和新斯的明联合使用均能够明显改善DSS引起的体重降低，改善DSS诱导的肠炎小鼠的疾病活动指数升高(粪便状态和便血程度)、抑制DSS引起的小鼠结肠长度缩短，并且山莨菪碱和新斯的明联合治疗的效果显著优于山莨菪碱(20mg/kg、大剂量)单独使用的治疗效果。此外，HE染色结果显示山莨菪碱和新斯的明联合治疗也能显著抑制DSS引起的小鼠结肠壁组织结构破坏。
(2)不同剂量的山莨菪碱和新斯的明联合治疗对溃疡性结肠炎急性发作的保护作用研究
根据上面的实验结果，我们将山莨菪碱和新斯的明联合(简称为新斯莨菪碱)分为低(5 mg/kg)、中(10 mg/kg)、高(20 mg/kg)三个剂量(以山莨菪碱的剂量折算)，然后将C57BL/6小鼠分为如下5组：CON组；DSS组；新斯莨菪碱低剂量组(5 mg/kg，i.p.)；新斯莨菪碱中剂量组(10 mg/kg，i.p.)；新斯莨菪碱高剂量组(20 mg/kg，i.p.)；第1组正常饮水，其余四组喂3%的DSS水溶液7天制备溃疡性结急性发作模型，然后观察不同剂量的新斯莨菪碱治疗对溃疡性结肠炎急性发作的保护作用，观察指标包括造模过程中动物的体重变化和粪便状态、疾病活动指数、造模以后地结肠长度变化以及结肠壁组织病理改变。
实验结果如下：我们发现，与DSS组小鼠相比，治疗性给予新斯莨菪碱中、高剂量均能显著降低DSS诱导的肠炎小鼠的疾病活动指数，明显改善DSS引起的体重的下降，同时抑制DSS引起的小鼠结肠长度的缩短，其作用具有剂量依赖性。此外，HE染色结果显示中、高剂量新斯莨菪碱均能显著抑制DSS对小鼠结肠壁组织结构的破坏。此外，我们也检测了新斯莨菪碱处理对小鼠肠道组织中促炎因子表达的影响，发现DSS造模以后肠道组织中促炎因子TNF-α、IL-6、IFN-γ、IL-22的mRNA水平表达升高，而新斯莨菪碱(10 mg/kg)治疗能显著抑制DSS诱导的TNF-α、IL-6、IFN-γ、IL-22mRNA升高；同时，ELISA检测结果发现DSS能诱导肠道组织中TNF-α、IFN-γ水平显著升高，新斯莨宕碱治疗后能显著抑制DSS诱导的TNF-α、IFN-γ水平升高。这些结果表明山莨菪碱和新斯的明联合治疗能显著改善溃疡性结肠炎急性发作的严重程度，且其治疗效应具有剂量依赖性。
结论：山莨菪碱单独使用和山莨菪碱、新斯的明联合使用均能显著改善溃疡性结肠炎急性发作的严重程度，而且山莨菪碱、新斯的明联合使用的效果要优于大剂量山莨菪碱单独使用的效果；此外，不同剂量的山莨菪碱、新斯的明联合对溃疡性结肠炎的保护作用具有剂量依赖性。
(二)山莨菪碱和新斯的明联合使用保护溃疡性结肠炎急性发作的机制探讨
(1)观察山莨菪碱和新斯的明联合治疗对溃疡性结肠炎时肠道自噬的影响
在整体动物水平，通过Westernblot技术检测造模前后以及给予新斯莨菪碱治疗后结肠组织中自噬相关蛋白LC-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1、P62/SQSTM1的表达变化，探究自噬在新斯莨菪碱治疗溃疡性结肠炎中的作用。结果表明，DSS能显著诱导结肠组织中LC-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1的表达上调，给予新斯莨菪碱治疗后自噬相关蛋白LC-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1表达进一步升高，P62/SQSTM1则进一步降低。这些结果表明自噬可能参与了新斯莨菪碱对溃疡性结肠炎急性发作的保护作用。
在细胞水平，我们利用LPS/DSS处理CACO-2细胞建立模型，然后给予新斯莨菪碱治疗，通过Westernblot技术检测了肠上皮细胞CACO-2造模前后以及给予新斯莨菪碱治疗后自噬相关蛋白LC-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1、P62/SQSTM1的表达变化。结果发现LPS/DSS处理能显著增加CACO-2细胞中LC-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1的表达，利用山莨菪碱和新斯的明联合预处理后LC-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1表达进一步升高；自噬底物P62/SQSTM1的表达则进一步降低。此外，我们还用AdPlus-mCherry-GFP-LC3B腺病毒联合免疫荧光技术来检测LPS/DSS造模前后以及新斯莨菪碱治疗前后CACO-2肠上皮细胞中自噬流的变化。结果发现LPS/DSS处理能显著提高CACO-2细胞的自噬流水平，利用新斯莨菪碱预处理后细胞的自噬流进一步增强，这些结果表明细胞水平的自噬变化趋势与组织水平的变化是一致的。
结论：新斯莨菪碱能显著提高溃疡性结肠炎时的肠道自噬水平。
(2)观察新斯莨菪碱增强肠道自噬的作用与其治疗溃疡性结肠炎急性发作的关系
首先，我们在体外培养的CACO-2细胞上转染ATG5siRNA阻断自噬，观察新斯莨菪碱处理前后对LPS/DSS刺激的CACO-2细胞促炎因子表达的影响，结果发现LPS/DSS刺激后，肠上皮细胞中促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6的mRNA表达水平显著升高，而新斯莨菪碱预处理能显著抑制LPS/DSS刺激诱导的TNF-α、IL-1β、IL-6升高，然而，在转染ATG5siRNA阻断自噬以后，新斯莨菪碱抑制TNF-α、IL-1β、IL-6表达的作用则被部分取消了，说明自噬可能介导了新斯莨菪碱对LPS/DSS刺激的肠上皮细胞炎症的抑制作用。
为了进一步探讨自噬在新斯莨菪碱保护溃疡性结肠炎急性发作中的作用，我们在DSS诱导的溃疡性结肠炎小鼠上，给予自噬抑制剂3-MA(10 mg/kg，i.p.)预处理，然后观察其对新斯莨菪碱治疗作用的影响，结果发现3-MA能显著抑制新斯莨菪碱的改善小鼠体重下降、降低疾病活动指数、抑制结肠长度缩短、减轻肠道组织结构破坏等作用，此外，3-MA也取消了新斯莨菪碱治疗对溃疡性结肠炎小鼠肠道组织中促炎因子TNF-α、IL-6、IFN-γ、IL-22的抑制作用。
结论：新斯莨菪碱治疗能通过促进肠道上皮细胞自噬，减轻肠道炎症，抑制溃疡性结肠炎急性发作的发生，对溃疡性结肠炎急性发作起到保护作用。
(三)山莨菪碱和新斯的明联合治疗对溃疡性结肠炎急性发作的靶点验证
我们将C57BL/6小鼠分成5组：CON组、DSS组、DSS+ANI/NEO组(10 mg/kg， i.p.)、DSS+MLA组(10 mg/kg，i.p.)、DSS+MLA(10 mg/kg，i.p.)+ANI/NEO(10 mg/kg，i.p.)组。CON组小鼠正常饮水，其余四组喂3%的DSS水溶液连续7天，制备溃疡性结肠炎急性发作模型，分别观察造模过程中动物体重变化和粪便状态、疾病活动指数、造模后的结肠长度变化。
实验结果如下：单独使用MLA对DSS诱导的结肠炎无影响，而在新斯莨菪碱治疗前给予MLA，则部分取消了新斯莨菪碱对溃疡性结肠炎急性发作的保护作用：改善小鼠体重下降、降低疾病活动指数、抑制结肠长度缩短。
结论：MLA的使用初步表明新斯莨菪碱对溃疡性结肠炎急性发作的保护作用可能与?7nAChR有关。
山莨菪碱(Anisodamine，ANI)是我国科学家从茄科植物唐古特莨菪中提取出来的一种生物碱，是毒蕈碱乙酰胆碱受体阻断剂，新斯的明(neostigmine，NEO)是一种胆碱酯酶抑制剂。在本课题组前期研究发现把山莨菪碱和新斯的明以500:1组成复方，可以一方面通过山莨菪碱阻断M受体，另一方面通过新斯的明抑制胆碱酯酶的活性，减少ACh的水解，两方面协同地增加ACh的浓度，进而激活?7nAChR发挥抗炎作用。除此之外，我们在LPS诱导的脓毒症小鼠模型[7]、小鼠类风湿性关节炎[8]和大鼠挤压综合征[9]等动物模型上均发现山莨菪碱和新斯的明联合应用能产生有意义的治疗作用。然而，山莨菪碱和新斯的明联合应用在溃疡性结肠炎急性发作中是否具有作用及机制并不清楚。
因此，本课题对山莨菪碱和新斯的明联合治疗溃疡性结肠炎急性发作的作用及机制进行研究，主要分成三部分：第一部分中，探究山莨菪碱和新斯的明联合治疗溃疡性结肠炎急性发作的作用；第二部分中，探究山莨菪碱和新斯的明联合治疗溃疡性结肠炎急性发作的具体机制。第三部分中，对山莨菪碱和新斯的明联合治疗溃疡性结肠炎急性发作的靶点进行验证。
(一)山莨菪碱和新斯的明联合治疗对溃疡性结肠炎急性发作具有保护作用
(1)山莨菪碱、新斯的明分别单独使用以及山莨菪碱和新斯的明联合使用对溃疡性结肠炎急性发作的作用研究
我们将C57BL/6小鼠分成5组：CON组、DSS组、DSS+ANI(20 mg/kg，i.p.)组、DSS+NEO(40μg/kg，i.p.)组、DSS+ANI(10 mg/kg，i.p.)+NEO(20μg/kg，i.p.)组；CON组小鼠正常饮水，其余四组喂3%的DSS水溶液连续7天，制备溃疡性结肠炎急性发作模型，分别观察造模过程中动物体重变化和粪便状态、疾病活动指数、造模后地结肠长度变化、结肠壁组织病理变化。
实验结果如下：山莨菪碱单独使用以及山莨菪碱和新斯的明联合使用均能够明显改善DSS引起的体重降低，改善DSS诱导的肠炎小鼠的疾病活动指数升高(粪便状态和便血程度)、抑制DSS引起的小鼠结肠长度缩短，并且山莨菪碱和新斯的明联合治疗的效果显著优于山莨菪碱(20mg/kg、大剂量)单独使用的治疗效果。此外，HE染色结果显示山莨菪碱和新斯的明联合治疗也能显著抑制DSS引起的小鼠结肠壁组织结构破坏。
(2)不同剂量的山莨菪碱和新斯的明联合治疗对溃疡性结肠炎急性发作的保护作用研究
根据上面的实验结果，我们将山莨菪碱和新斯的明联合(简称为新斯莨菪碱)分为低(5 mg/kg)、中(10 mg/kg)、高(20 mg/kg)三个剂量(以山莨菪碱的剂量折算)，然后将C57BL/6小鼠分为如下5组：CON组；DSS组；新斯莨菪碱低剂量组(5 mg/kg，i.p.)；新斯莨菪碱中剂量组(10 mg/kg，i.p.)；新斯莨菪碱高剂量组(20 mg/kg，i.p.)；第1组正常饮水，其余四组喂3%的DSS水溶液7天制备溃疡性结急性发作模型，然后观察不同剂量的新斯莨菪碱治疗对溃疡性结肠炎急性发作的保护作用，观察指标包括造模过程中动物的体重变化和粪便状态、疾病活动指数、造模以后地结肠长度变化以及结肠壁组织病理改变。
实验结果如下：我们发现，与DSS组小鼠相比，治疗性给予新斯莨菪碱中、高剂量均能显著降低DSS诱导的肠炎小鼠的疾病活动指数，明显改善DSS引起的体重的下降，同时抑制DSS引起的小鼠结肠长度的缩短，其作用具有剂量依赖性。此外，HE染色结果显示中、高剂量新斯莨菪碱均能显著抑制DSS对小鼠结肠壁组织结构的破坏。此外，我们也检测了新斯莨菪碱处理对小鼠肠道组织中促炎因子表达的影响，发现DSS造模以后肠道组织中促炎因子TNF-α、IL-6、IFN-γ、IL-22的mRNA水平表达升高，而新斯莨菪碱(10 mg/kg)治疗能显著抑制DSS诱导的TNF-α、IL-6、IFN-γ、IL-22mRNA升高；同时，ELISA检测结果发现DSS能诱导肠道组织中TNF-α、IFN-γ水平显著升高，新斯莨宕碱治疗后能显著抑制DSS诱导的TNF-α、IFN-γ水平升高。这些结果表明山莨菪碱和新斯的明联合治疗能显著改善溃疡性结肠炎急性发作的严重程度，且其治疗效应具有剂量依赖性。
结论：山莨菪碱单独使用和山莨菪碱、新斯的明联合使用均能显著改善溃疡性结肠炎急性发作的严重程度，而且山莨菪碱、新斯的明联合使用的效果要优于大剂量山莨菪碱单独使用的效果；此外，不同剂量的山莨菪碱、新斯的明联合对溃疡性结肠炎的保护作用具有剂量依赖性。
(二)山莨菪碱和新斯的明联合使用保护溃疡性结肠炎急性发作的机制探讨
(1)观察山莨菪碱和新斯的明联合治疗对溃疡性结肠炎时肠道自噬的影响
在整体动物水平，通过Westernblot技术检测造模前后以及给予新斯莨菪碱治疗后结肠组织中自噬相关蛋白LC-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1、P62/SQSTM1的表达变化，探究自噬在新斯莨菪碱治疗溃疡性结肠炎中的作用。结果表明，DSS能显著诱导结肠组织中LC-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1的表达上调，给予新斯莨菪碱治疗后自噬相关蛋白LC-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1表达进一步升高，P62/SQSTM1则进一步降低。这些结果表明自噬可能参与了新斯莨菪碱对溃疡性结肠炎急性发作的保护作用。
在细胞水平，我们利用LPS/DSS处理CACO-2细胞建立模型，然后给予新斯莨菪碱治疗，通过Westernblot技术检测了肠上皮细胞CACO-2造模前后以及给予新斯莨菪碱治疗后自噬相关蛋白LC-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1、P62/SQSTM1的表达变化。结果发现LPS/DSS处理能显著增加CACO-2细胞中LC-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1的表达，利用山莨菪碱和新斯的明联合预处理后LC-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1表达进一步升高；自噬底物P62/SQSTM1的表达则进一步降低。此外，我们还用AdPlus-mCherry-GFP-LC3B腺病毒联合免疫荧光技术来检测LPS/DSS造模前后以及新斯莨菪碱治疗前后CACO-2肠上皮细胞中自噬流的变化。结果发现LPS/DSS处理能显著提高CACO-2细胞的自噬流水平，利用新斯莨菪碱预处理后细胞的自噬流进一步增强，这些结果表明细胞水平的自噬变化趋势与组织水平的变化是一致的。
结论：新斯莨菪碱能显著提高溃疡性结肠炎时的肠道自噬水平。
(2)观察新斯莨菪碱增强肠道自噬的作用与其治疗溃疡性结肠炎急性发作的关系
首先，我们在体外培养的CACO-2细胞上转染ATG5siRNA阻断自噬，观察新斯莨菪碱处理前后对LPS/DSS刺激的CACO-2细胞促炎因子表达的影响，结果发现LPS/DSS刺激后，肠上皮细胞中促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6的mRNA表达水平显著升高，而新斯莨菪碱预处理能显著抑制LPS/DSS刺激诱导的TNF-α、IL-1β、IL-6升高，然而，在转染ATG5siRNA阻断自噬以后，新斯莨菪碱抑制TNF-α、IL-1β、IL-6表达的作用则被部分取消了，说明自噬可能介导了新斯莨菪碱对LPS/DSS刺激的肠上皮细胞炎症的抑制作用。
为了进一步探讨自噬在新斯莨菪碱保护溃疡性结肠炎急性发作中的作用，我们在DSS诱导的溃疡性结肠炎小鼠上，给予自噬抑制剂3-MA(10 mg/kg，i.p.)预处理，然后观察其对新斯莨菪碱治疗作用的影响，结果发现3-MA能显著抑制新斯莨菪碱的改善小鼠体重下降、降低疾病活动指数、抑制结肠长度缩短、减轻肠道组织结构破坏等作用，此外，3-MA也取消了新斯莨菪碱治疗对溃疡性结肠炎小鼠肠道组织中促炎因子TNF-α、IL-6、IFN-γ、IL-22的抑制作用。
结论：新斯莨菪碱治疗能通过促进肠道上皮细胞自噬，减轻肠道炎症，抑制溃疡性结肠炎急性发作的发生，对溃疡性结肠炎急性发作起到保护作用。
(三)山莨菪碱和新斯的明联合治疗对溃疡性结肠炎急性发作的靶点验证
我们将C57BL/6小鼠分成5组：CON组、DSS组、DSS+ANI/NEO组(10 mg/kg， i.p.)、DSS+MLA组(10 mg/kg，i.p.)、DSS+MLA(10 mg/kg，i.p.)+ANI/NEO(10 mg/kg，i.p.)组。CON组小鼠正常饮水，其余四组喂3%的DSS水溶液连续7天，制备溃疡性结肠炎急性发作模型，分别观察造模过程中动物体重变化和粪便状态、疾病活动指数、造模后的结肠长度变化。
实验结果如下：单独使用MLA对DSS诱导的结肠炎无影响，而在新斯莨菪碱治疗前给予MLA，则部分取消了新斯莨菪碱对溃疡性结肠炎急性发作的保护作用：改善小鼠体重下降、降低疾病活动指数、抑制结肠长度缩短。
结论：MLA的使用初步表明新斯莨菪碱对溃疡性结肠炎急性发作的保护作用可能与?7nAChR有关。