鸡球虫病是一种对养鸡业造成严重危害的寄生性原虫病。目前,鸡球虫病的防治主要依靠化学药物,但由于鸡球虫对已使用过的抗球虫药物产生了严重的抗药性,因此寻找新的药靶、研发新型药物迫在眉睫。研究表明,糖基化修饰不仅影响蛋白质的空间构象、生物活性、运输和定位,在分子识别和信号转导中也发挥着至关重要的作用,此外,糖基化修饰在寄生虫入侵宿主细胞过程中也发挥重要作用。因此,球虫发育过程中参与糖基化修饰的关键酶有望作为抗球虫药物设计的新靶点。目前,在弓形虫、隐孢子虫、疟原虫等顶复门原虫中已报道存在糖基化修饰,而有关球虫糖基化修饰的报道相对较少。本研究通过定性蛋白质质谱分析,发现在球虫中也同样存在糖基化修饰。有文献表明UDP-N-乙酰-D-半乳糖胺:多肽N-乙酰氨基半乳糖转移酶T2(EtppGalNAc-T2)和UDP-N-乙酰葡糖胺1磷酸转移酶(EtGPT)是糖基化修饰途径中的关键酶,在糖基化修饰中发挥重要作用。本研究主要对EtppGalNAc-T2和EtGPT进行克隆并原核表达,同时对它们在E.tenella不同发育阶段转录量水平进行了分析。首先利用质谱技术对柔嫩艾美耳球虫裂殖子、未孢子化卵囊、孢子化7 h卵囊、孢子化卵囊和子孢子5个发育阶段的虫体蛋白质进行了检测,分别鉴定出15个、9个、9个、9个和10个糖基化修饰相关的蛋白质。通过GO分析发现这些糖基化蛋白主要参与“生物学过程的调控结合和催化活性”以及“细胞和细胞成分”等功能。通过KEGG通路分析,发现它们主要参与的通路为核糖体,其次为碳代谢、糖酵解/糖异生等。上述结果说明球虫中存在糖基化修饰并可能对其生长发育起到一定作用。进一步通过分子克隆得到了EtppGalNAc-T2和EtGPT的全长ORF,分别为1983 bp和1089 bp,对应编码的蛋白质大小为75.14 ku和39.25 ku。并运用生物信息学软件进行初步分析,发现EtppGalNAc-T2和EtGPT均无信号肽序列,表明它们是在胞内定位并发挥生物学活性,对应的理论等电点分别为8.66和7.92。其次,本研究成功构建了pET30a-EtGPT和p GEX-6p-1-EtppGalNAc-T2原核表达载体,并将重组质粒转入表达菌Transetta(DE3)中,表达获得EtppGalNAc-T2-MBP和EtGPT-HIS融合蛋白。最后,采用实时荧光定量PCR检测和相对定量法计算EtppGalNAc-T2和EtGPT mRNA在E.tenella不同发育阶段转录量水平。结果显示,EtppGalNAc-T2和EtGPT在E.tenella不同发育阶段的表达量均有明显差异,二者均在子孢子阶段的表达量达到最高,而在孢子化卵囊阶段降到最低,暗示这两种糖基转移酶在球虫的不同发育阶段发挥不同的作用,并推测糖基化修饰对柔嫩艾美耳球虫的生长发育在某种程度上起到调控作用。上述实验结果说明,EtppGalNAc-T2和EtGPT作为胞内定位的修饰蛋白在球虫生长发育过程中发挥重要的作用,有望作为抗球虫药物的潜在靶标。本研究为进一步探讨它们在糖基化修饰中的作用以及对后续抗球虫药物的研发奠定了一定的理论基础。