果蔬汁主要由浆液和浑浊态物质构成。浑浊态在果蔬汁的颜色、风味、质地等感官品质方面发挥重要作用，然而果蔬汁在储存过程中，经常会发生浑浊态消失(cloud loss)的现象，这主要是由于果蔬汁内源果胶甲酯酶对果胶的脱甲酯化作用而产生的。果胶甲酯酶抑制剂(PMEI)可有效抑制植物内源果胶甲酯酶(PME)的活性，为解决果蔬汁混浊态消失提供了一个非常具有应用前景的方法。然而从植物体中直接提取PMEI很困难，并且产量很低，目前只是从猕猴桃果实中获取到该抑制剂。本文利用巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)高效表达出猕猴桃的果胶甲酯酶抑制剂，毫无疑问，这将有力促进果胶甲酯酶抑制剂在果蔬汁中的应用。 (1)从新鲜成熟的猕猴桃果实中提取总RNA，立即被反转录成cDNA。根据GenBank中已发表的猕猴桃果胶甲酯酶抑制剂PMEI的cDNA序列，设计合成特异引物，以猕猴桃cDNA为模板，通过RT-PCR得到-DNA产物，该序列与已发表的PMEI序列的同源性很高，被命名为kWPMEI。 (2)经过EcoR Ⅰ和Not Ⅰ的双酶切作用，将kWPMEI定向插入到质粒pPIC9K的多克隆位点(MCS)上，获得重组表达质粒pPIC9K/kWPMEI。经Sac Ⅰ线性酶切处理后，该质粒通过电转化的方法被整合到巴斯德毕赤酵母KM71的基因组中，获得His<+>转化子，再经G418抗性的二次筛选，最终获得6株含高拷贝kWPMEI的重组毕赤酵母菌株。 (3)将含不同拷贝数的重组菌株，在BMGY/BMMY培养基中进行表达，将表达出来的目的蛋白命名为kWPMEI。实验结果表明kWPMEI的表达量与重组菌株所含的拷贝数增加成正相关性，即重组菌株所含拷贝数越多，kWPMEI的表达量越高。此外，kWPMEI可被直接分泌到培养基中，占上清液蛋白量的绝大多数，因此通过一步凝胶过滤层析法即被纯化出来。 (4)通过凝胶扩散实验，分别检测。kWPMEI对番茄、桔子和胡萝卜PME的抑制作用，发现kWPMEI对上述三种植物的PME均有抑制活性。kWPMEI对桔子PME的抑制能力最强，其次是胡萝卜，最弱的是番茄。同时kWPMEI对上述三种植物PME的抑制活性受环境温度和pH的影响比较显著。 (5)将含高拷贝kWPMEI的重组菌株在不同的发酵条件下进行表达，最终确定使用BMMY培养基、表达时间为96h、培养基装填量为10％时为最佳表达条件。在最佳表达条件下，kWPMEI表达量最高可达200mg/L。