乙酰胆碱酯酶（Acetyl Cholinesterase，AChE）是一种多分子型糖蛋白，存在于生物体内神经组织、肝脏、肌肉、红细胞以及脾脏中，在生物神经传导中起重要作用，其活性受有机磷和氨基甲酸酯类农药特异性抑制，AChE的活性变化是敏感的农药毒理学指标，可被应用于农药的毒性和环境污染评价的生物标记物。因而关于AChE的研究成为环境、农药、毒理领域的研究热点。鱼类是水生生态系统中对有机磷农药（Organophosphorus pesticides OPs）较敏感的一类动物，而关于淡水鱼类乙酰胆碱酯酶的研究鲜见报道。　　 本文首次以淡水鱼类鲫鱼为对象，提取其脑、肝脏、肌肉中的AChE并进行分离纯化，对其生化性质进行了研究。进而以六种有机磷农药为抑制剂，探讨和评价了鲫鱼AChE对有机磷农药的敏感性。建立了两种有机磷农药敌敌畏和辛硫磷的化学发光快速分析方法；建立了鲫鱼中辛硫磷残留量的高效液相色谱分析法。研究结论如下：　　 1．以鲫鱼、兔、鸡为AChE酶源，测定并比较了三种动物以及同一动物的不同部位的蛋白质含量，AChE酶活及对有机磷农药敌敌畏的敏感性指标IC50。研究结果为：七种酶源中，鲫鱼脑AChE比酶活最高，达105.59μmol/min.g，而其IC50值仅为8.168μg/mL，为所筛选酶源中的最低值。故确定鲫鱼为AChE酶源。　　 2．首次运用正交实验法探讨了鲫鱼脑、肝脏、肌肉中AChE的提取条件的优化组合。研究结论为：鲫鱼脑、肝脏和肌肉乙酰胆碱酯酶的最佳提取条件为，提取液为pH值为8.0的磷酸盐缓冲溶液、匀浆比为1：4。在此条件下鲫鱼脑、肝脏和肌肉中AChE的比酶活最高，比酶活力值最大。其AChE比酶活分别为149μmol/min.g，13μmol/min．g和262μmol/min.g。　　 3．运用中心组合实验和响应面分析法得鲫鱼脑、肝、肌肉AChE比酶活测定最佳条件组合为，鱼脑酶活测定的最佳条件为保温时间35min，保温温度32℃，pH值7.6。肝脏酶活测定的最佳条件为保温时间28mm，保温温度30℃，pH值7.6。肌肉酶活测定的最佳条件为保温时间31min，保温温度31℃，pH值7.6。　　 4．鲫鱼脑、肝、肌肉AChE的生化性质参数及对六种有机磷农药的敏感性评价指标结果如下：　　 4.1鲫鱼脑部、肝脏、肌肉中AChE粗提取液的米氏常数Km值分别为1.063mmol/L，7.864mmol/L，4.028mmol/L；最大反应速度Vmax值分别为52.91mmol/(L.min)，31.746mmol/(L.min)，135.13mmol/(L.min);测得Km值可知：在有机磷农药敌敌畏抑制条件下，鲫鱼脑部乙酰胆碱酯酶与底物亲和力最强，其次是肌肉，肝脏中乙酰胆碱酯酶与底物亲和力最弱。　　 4.2鲫鱼脑部、肝脏、肌肉中AChE粗提取液对有机磷农药敌敌畏的双分子速率常数Ki值分别为1.011L/(g.min)，0.472L/(g.min)，0.173L/(g.min)。由测得Ki值可知：对于有机磷农药敌敌畏的抑制，鲫鱼脑部乙酰胆碱酯酶的敏感性最强，其次是肝脏，肌肉中乙酰胆碱酯酶的敏感性最弱。　　 4.3通过测定鲫鱼脑部、肝脏、肌肉中AChE粗酶液对六种有机磷农药的IC50值，分析比较可得以下结论：　　 鲫鱼脑部AChE粗酶液对六种有机磷农药的敏感性由强到弱分别为：敌敌畏＞辛硫磷＞杀螟松＞三唑磷＞乐果＞倍硫磷。　　 鲫鱼肝脏AChE粗酶液对六种有机磷农药的敏感性由强到弱分别为：敌敌畏＞辛硫磷＞杀螟松＞乐果＞倍硫磷＞三唑磷。　　 鲫鱼肌肉AChE粗酶液对六种有机磷农药的敏感性由强到弱分别为：敌敌畏＞三唑磷＞辛硫磷＞杀螟松＞乐果＞倍硫磷。　　 4.4六种有机磷农药和胆碱酯酶强抑制剂毒扁豆碱对乙酰胆碱酯酶的抑制效应比较结果为：　　 鲫鱼各部分AChE对敌敌畏和毒扁豆碱表示出较强的敏感性，抑制曲线随时间呈良好的上升趋势，而其中肝脏的酶构成种类复杂，例如有超氧化物歧化酶(SOD)等，干扰较大，使趋势曲线杂乱。　　 5．对鲫鱼脑和肝脏AChE进行了纯化和初步结构表征。结果表明，鲫鱼肝脏AChE粗酶液经聚乙二醇双水相萃取，DEAE-Sephadex A-50离子交换柱层析后纯化后，纯化倍数达145倍。　　 鲫鱼脑AChE粗酶液经聚乙二醇双水相萃取，DEAE-Sephadex A-50离子交换柱层析和Sephadex G-200纯化后得到了较纯的乙酰胆碱酯酶(AChE)，纯化倍数达214倍。经紫外吸收光谱、红外光谱和圆二色谱分析证明，鲫鱼脑AChE纯化最终产物具有蛋白质和酶的相关结构特征。　　 6．建立了鲫鱼AChE为之敏感性高的两种有机磷农药敌敌畏和辛硫磷在实际样品种的化学发光快速分析方法，方法评价指标为：　　 6.1.在最佳反应条件下，辛硫磷浓度在1.0×10-8g/mL-1.0×10-6g/mL范围内时，△I与辛硫磷浓度成良好的线性关系，线性回归方程为y=121.43x+95232，相关系数r为0.9979，检出限为5.4×10-9g/mL;敌敌畏浓度在8.0×10-8g/mL-1.0×10-5g/mL范围内时，△I与敌敌畏浓度呈现良好的线性关系，线性回归方程为y=2013.7x+13292，相关系数为r=0.9997，检出限为6.0×10-8g/mL。　　 6.2.采用化学发光法和气相色谱法检测实际样品（小白菜）中辛硫磷含量，结果基本吻合；在实际样品（大白菜和生菜）中未检出敌敌畏，向实际样品中添加己知浓度的敌敌畏做回收率实验，回收率分别达124％和115%，达到了农药残留分析相关要求。　　 6.3.经紫外吸收光谱和荧光光谱验证，确定两种有机磷农药的化学发光反应机理为，鲁米诺溶液的最大发射波长在λmax=420nm处，发光体是3-氨基邻苯二甲酸根离子的激发态。向鲁米诺中加入H2O2后并没有新的发光物质生成，发光体仍然是3-氨基邻苯二甲酸根离子的激发态。加入辛硫磷和敌敌畏后体系的最大发射波长没有发生改变，说明发光体仍旧是3-氨基邻苯二甲酸根离子的激发态。　　 7．建立了鲫鱼体内辛硫磷残留量的HPLC分析法。方法的相对标准偏差为3.2%，线性范围为0.01-10μg/ml，回收率为79%-93%。