目的:结直肠癌（CRC）是世界上第三大常见的癌症,也是全球癌症致死率第四的癌症,每年约1,360,000例病例,约65万结直肠癌患者死亡。2018年,GLOBOCAN在线分析工具预测亚洲约有606,840个新病例产生。因此,对CRC的防治工作意义重大。SNRPA1是一种剪接体成分,负责将前体mRNA加工成mRNA,是许多类型癌症预后的生物标志物。除了其在介导RNA加工中的作用外,SNRPA1其他功能的研究尚未在结直肠癌中进行。基于目前对SNRPA1的研究,我们推测SNPRA1也应在CRC的进展中发挥重要作用。为了验证这一假设,我们设计生产了一种shRNA慢病毒,用于敲低SNRPA1的表达,并检测SNRPA1沉默对CRC细胞功能的后续影响,并探究其发生的分子机制。方法:1.设计小干扰RNA的作用靶点,合成加入了干扰序列的单链DNA寡核苷酸,退火配对之后产生双链DNA;然后将酶切处理以后的慢病毒载体通过两端的酶切位点接入;之后把连接后的产物转到已经制备好的感受态细胞;通过PCR筛选阳性重组子,然后将其测序验证,对与测序结果相比对匹配的克隆进行质粒抽提。使用高效重组载体和病毒包装质粒共转染293T细胞,进行病毒包装和生产。收集病毒液并进行浓缩、纯化,用高质量的病毒液感染293T细胞。测定病毒滴度,通过实时定量PCR和Western blot实验分析实验结果。最后用高质量的病毒液感染结直肠癌细胞,检测siRNA的沉默效率以及使用特定药物筛选稳定转染的细胞株。2.病毒液感染结直肠癌细胞敲低SNRPA1基因的表达后,通过Celigo细胞计数检测细胞的生长状态,及检测克隆形成能力,研究抑制SNRPA1基因表达对人结直肠癌细胞增殖的影响。通过MTT实验检测抑制SNRPA1基因表达对人结直肠癌细胞活力的影响。通过Caspase3/7检测,研究抑制SNRPA1基因表达对人结直肠癌细胞凋亡的影响。3.通过裸鼠成瘤实验研究抑制SNRPA1基因表达对人结直肠癌细胞在动物体内生物学特性的影响。通过基因芯片筛选出差异基因。之后通过IPA分析结果,找到疾病功能分析结果中分别与肿瘤细胞增殖和凋亡相关的基因,选择抑制肿瘤细胞增殖或者促进肿瘤细胞凋亡的基因,通过查阅资料选择目的基因并绘制其中的基因关系网络图。研究SNRPA1基因影响下游哪些基因的表现,从而影响细胞的增殖。最后通过实时定量PCR和western blot实验验证基因组学的结果。结果:1.成功筛选出了有效的SNRPA1 siRNA序列,并成功构建了重组慢病毒SNRPA1 shRNA表达载体。转染人结直肠癌细胞RKO和HCT116后可明显下调SNRPA1 mRNA与其蛋白的表达水平。2.和对照组相比,SNRPA1敲低组RKO或HCT116细胞的细胞增殖和细胞活力受到明显的抑制。为了证实SNRPA1敲低对CRC细胞凋亡的影响,检测了shRNA慢病毒转导后敲低组和对照组中激活的半胱氨酸蛋白酶3/7活性。结果显示,与对照组相比,sh SNRPA1慢病毒转导的RKO或HCT116细胞中的半胱氨酸蛋白酶3/7活性显著升高,表明RKO或HCT116细胞在sh SNRPA1慢病毒转导后经历了凋亡的增加。因此,SNRPA1敲低可以促进RKO或HCT116细胞的凋亡。3.基因芯片结果显示,SNRPA1基因敲低后,RKO细胞有602个基因上调,765个基因下调。选择抑制肿瘤细胞增殖或者促进肿瘤细胞凋亡的基因并添加SNRPA1基因后绘制基因关系网络图,发现共有38个与SNRPA1相互作用的基因,包括17个上调基因和21个下调基因。从网络中发现,SNRPA1可能通过作用于EGFR和HGF,影响下游一系列基因的表现,从而影响细胞的增殖。对这些基因进行qRT-PCR验证后发现,结果基本与芯片一致。另外,对其中感兴趣的基因通过免疫印迹验证发现,SNRPA1敲低后,NRP1和PIK3R1基因表达升高,E2FZ,VEGFC,MKI67,CDK1基因表达下降。表明SNPRA1会通过与EZH2,VEGFC,MKI67,NRP1,PIK3R1,CDK1等基因的相互作用而影响CRC的发生发展。结论:SNRPA1的敲低会通过上调NRP1,PIK3R1和下调E2FZ,VEGFC,MKI67,CDK1等影响CRC细胞的增殖和凋亡,从而在CRC发生发展中起重要作用。本研究发现并SNRPA1除了参与RNA进程外,在CRC发生发展中也起着重要的作用。这些新发现将为将来在CRC诊断和治疗中开发新的诊断指标或治疗靶标提供依据。