【摘 要】
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腈水合酶（NHase）是一种能将氰基转化为酰胺基的金属酶,它以反应条件温和、专一性强和环境友好等优点已经用于工业规模催化生产精细化学品。但是天然NHase仍然存在底物亲和力低和热稳定性差等不足,因此需要对酶进行适当改造。定向进化技术的发展极大促进了人工改造酶催化性能的进程。半理性设计策略作为定向进化的一种,将酶的结构和功能信息与高通量筛选方法相结合大大减少了酶改造的工作量并提高了改造效率。使用半理
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腈水合酶（NHase）是一种能将氰基转化为酰胺基的金属酶,它以反应条件温和、专一性强和环境友好等优点已经用于工业规模催化生产精细化学品。但是天然NHase仍然存在底物亲和力低和热稳定性差等不足,因此需要对酶进行适当改造。定向进化技术的发展极大促进了人工改造酶催化性能的进程。半理性设计策略作为定向进化的一种,将酶的结构和功能信息与高通量筛选方法相结合大大减少了酶改造的工作量并提高了改造效率。使用半理性设计的方法对Rhodococcus erythropolis CCM2595来源腈水合酶（Re NHase）的底物亲和力进行改造,提高Re NHase与己二腈分子的底物亲和力,这将为NHase或其他酶底物亲和力的改造提供一定的实验和理论依据,同时也增加了该酶工业应用的可能性。本研究首先对Re NHase进行Protein Blast分析搜索同源氨基酸序列,选取合适模板用SWISS-MODEL网站进行同源建模。然后,使用Discovery Studio（DS）软件进行分子对接、丙氨酸扫描和计算结合能,找到亲和力提高的虚拟突变位点。接下来根据虚拟氨基酸结果构建突变体重组质粒并进行异源表达。优化Re NHase纯化方法获得纯度较高的Re NHase,然后在不同温度和p H下探究突变体Re NHase的酶学性质以及酶动力学分析。最后对突变体Re NHase进行分子动力学模拟并分析其与己二腈的相互作用力。主要研究结果如下:（1）通过Ramanchandran Plot和Profile-3D评估证明本研究构建了质量可靠的Re NHase 3D模型。使用DS软件虚拟氨基酸突变计算获得七个底物亲和力可能提高的突变体,并且成功构建突变体Re NHase重组质粒。（2）弱阴离子层析纯化得到的Re NHase比酶活是181.443±6.879 U/mg,是His标签纯化的2.5倍。（3）酶学性质分析表明Re NHaseB:G196Y、Re NHaseB:G196V、Re NHaseB:G196H和Re NHaseB:G196N的最适p H和最适温度与野生型Re NHase相比没有较大的变化,但是Re NHaseB:G196N、Re NHaseB:G196V和Re NHaseB:G196H具有较好的碱性环境耐受性。酶动力学分析表明,相较于野生型Re NHase,Re NHaseB:G196Y的Km为5.717±0.316 mmol.L-1,底物亲和力比Re NHase提高36.35%,另外Re NHaseB:G196Y的催化效率比Re NHase提高10.11%。（4）分子动力学模拟显示Re NHaseB:G196Y的氨基酸骨架稳定性与Re NHase相比没有改变,但Re NHaseB:G196Y在突变位点附近的氨基酸灵活性有所增加,其与己二腈形成氢键的氨基酸位点由A:V138变为B:A186,并且键长由原来的2.62?缩短为2.03?。突变位点附近氨基酸灵活性的增加以及氢键键长的缩短可能是Re NHaseB:G196Y底物亲和力和催化效率提高的原因。结论:基于半理性设计策略使用Discovery Studio软件对Re NHase进行虚拟氨基酸突变得到突变体Re NHaseB:G196Y,其底物亲和力比Re NHase提高36.35%,催化效率提高10.11%。以上结果将增加该酶工业应用的可能性,并为后续NHase的改造提供理论依据和实验依据。
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