目的:近20年,随着医学生物技术不断更新以及实验手段的多元化发展,人们对肿瘤标记物的作用越来越感兴趣,目前很多标记物在治疗及筛查均起到非常重要的作用,其中ER,PR,HER-2,Ki-67等乳腺恶性肿瘤的标记物已应用于临床工作。虽然这四种标记物,对乳恶性肿瘤的内分泌、靶向治疗具有指导意义,但是无法准确的判断生存时间,也无法提供更多的信息来指导术后化疗。因此我们迫切需要、发现更多的能够精确判断预后、指导全身治疗的标记物。受体相关蛋白80（RAP80）是BRCA1的成员,BRCA1是一种复合物,在调节细胞周期检查点和细胞核DNA损伤修复中发挥重要作用。RAP80功能与其在DNA断裂点结合泛素和小泛素修饰物的能力密切相关。RAP80的相互作用基序（SIM）或其两个泛蛋白相互作用基序（UIMs）中的任何一个的失活均会损害RAP80对DNA损伤位点的定位,并增加对电离辐射的敏感性[1-5]。鉴于RAP80在保持基因组完整性方面的重要性,过去十年里,人们已经做了大量工作来理解RAP80是如何调节DSB修复的,并揭示RAP80与泛素和SUMO相互作用的机制。在这篇综述中,我们研究了 RAP80在乳腺癌及其配对正常乳腺组织中的表达,进一步分析了其在乳腺癌细胞生物学行为中的作用。方法:组织标本来源2010年2月至2011年9月,新鲜乳腺组织样本从中国医科大学第一附属医院乳腺外科收集,包括导管原位癌、浸润性乳腺导管癌组织及其配对的正常乳腺组织（距离原发癌组织＞2厘米）。所有病人术前没接受放化疗。年龄范围24岁～79岁不等,平均年龄为51.8岁。使用医院病历回顾临床病理信息。免疫组化福尔马林固定和石蜡包埋的样品切片切成厚度4um的切片,一抗用RPA80单克隆抗体孵育。免疫组织化学染色采用S-P试剂盒,严格按照制造商的说明书进行操作,不断摸索、优化条件。PBS被用来代替阴性对照的初级抗体。染色强度和面积范围由德国半定量评分系统评分。乳腺癌细胞系培养MCF-7、ZR-75和MDA-MB-231三种乳腺癌细胞系作为备选实验所用的细胞进行筛选,细胞培养基我们选择了 RPMI 1640培养基（Gibco,美国）或DMEM培养基（Gibco,美国）,根据实验要求加入10%胎牛血清（FBS）（Hyclone,美国）,所有细胞需要在37℃的5%CO2培养箱内培养。细胞系从美国组织培养物储存中心（Manasas,美国）获得,保存在中国医科大学第一附属医院和基础医学院病理科实验室（中国沈阳）。Western blot和实时定量PCR分析乳房组织或乳腺癌细胞用4°磷酸盐缓冲液洗涤,裂解液中溶解、裂解。裂解产物用超声震荡处理10s,在12000rpm离心20分钟。等量目的蛋白通过12%SDS-PAGE溶解并转移到PVDF膜上。加入一抗后在4℃冰箱内过夜,第二天加入二抗、室温下孵育1小时。然后使用生物成像系统分析蛋白质带。RAP80的灰度值被标准化为相应的GAPDH蛋白带的值,以确定蛋白质的表达水平。这些实验独立重复至少三次。用Trizol试剂提取乳腺细胞组织中的总RNA,并用纳米光度计以A260/A280比率分析RNA的质量。比率介于1.6和1.8之间。用RNA PCR试剂盒进行逆转录,上述操作完全按照说明书里要求进行。将所选基因的表达标准化为内参。这些实验独立重复至少三次。细胞转染:人类RAP80基因序列是从基因库获得的。根据siRNA的设计原则,上海基因制药公司负责设计siRNA序列并针对特定的RAP80进行合成。先在24孔板内培养MCF-7细胞24小时。按照说明书完成转染步骤。48小时后收集细胞并提取目的蛋白,同时确定其表达情况。在Western blot中使用RAP80 siRNA组和阴性对照siRNA来验证RAP80的下调。基质胶侵入试验:将基质凝胶（100ul/ml）铺到膜的上表面。细胞转染处理48小时和72小时后,将细胞接种于上室,培养18小时,然后对那些侵入膜表面的细胞进行固定、染色,观察期迁移、侵袭能力。MTT实验:通过MTT测定在不同时间点评估细胞增殖。简而言之,将已经转染的MCF-7细胞以及对照组MCF-7细胞均接种于96孔板,每个孔接种大约2000个细胞（八次重复）,8小时后各孔（位于板边缘的孔不加药）加入不同浓度的顺铂,24小时以后向每个孔中加入5mg/ml MTT,相互作用3小时。通过加入150ul/孔二甲亚砜裂解细胞,并在微孔板读取器中以为570nm吸收波长读取。这些实验独立重复至少三次。根据相应的剂量反应曲线计算顺铂的IC50值。流式细胞术测定凋亡简而言之,每组细胞均接种在六孔板培养板总。细胞转染48小时后加顺铂,用药物处理后,再培养细胞24小时、48小时,然后收集。上流式细胞仪。这些实验独立重复至少三次。统计方法:实验结果采用SPSS 13.0版本进行统计学分析。Pearson卡方检验用于分析乳腺癌中RAP80表达与患者的临床病理因素之间的关系。采用单向方差分析（ANOVA）来比较Western blotting,RT-PCRq,MTT、FAS、以及基质胶侵入实验中实验组与对照组之间的差异。本研究中的统计显著性被设定为p＜0.05。结果:免疫组化结果显示,乳腺癌组织及乳腺组织的乳腺上皮中RAP80蛋白主要是在细胞核染色。RAP80在乳腺导管浸润癌中的总阳性率为62.3%,正常乳腺组织中的RAP80的阳性率为86.75%,差异具有统计学意义。RAP80表达与肿瘤的组织学分级、患者的年龄无关（p＞0.05）。但RAP80的表达与雌激素受体或孕激素受体表达、肿瘤的大小、TNM分期、Ki67状态还有淋巴结情况有关（p＜0.05）。qRT-PCR结果显示,三阴性乳腺癌中的RAP80 mRNA表达明显低于其他类型。RAP80 mRNA表达与雌激素受体或孕激素受体表达、Ki67状态还有淋巴结情况相关（p＞0.05）。RAP80 mRNA表达与年龄、CerbB-2是否扩增、病理组织学分级以及TNM分期均无关联（p＞0.05）。RAP80在乳腺癌细胞系中的表达和RAP80 siRNA在MCF-7中的表达:三组细胞中的检测结果提示无论是mRNA水平还是蛋白水平,其表达均是在MCF-7中很明显,在其他两种乳腺癌细胞系内表达均不理想。因此,在下步实验中我们选择了 MCF-7细胞作为研究对象,并进一步研究了 RAP80在MCF-7生物学行为中的作用。使Western blot和RT-PCRq分析,在RAP80 siRNA-NC转染组或野生型MCF-7中观察到明显的RAP80蛋白和mRNA表达,在RAP80 siRNA转染组中非常弱（图2）。表明RAP80 siRNA对MCF-7中RAP80的有效下调。RAP80 siRNA转染对MTT细胞增殖的影响:两种细胞的存活率呈剂量依赖性下降,顺铂在MCF-7 RAP80 siRNA细胞中的IC50值为0.83 g/ml,在野生型MCF-7中为1.69g/ml。RAP80 siRNA 转染上调 MCF-7 细胞凋亡。流逝细胞实验提示:向三组MCF-7细胞系加入化疗药物顺铂,药物反应24小时和48小时后,RAP80 siRNA转染组的细胞凋亡率分别为46.8%和52.7%,高于siRNA-NC转染组（加药后24小时为13.1%,加药48小时为10.7%）或未经处理的MCF-7组（加药后24小时为15.1%,加药48小时为12.9%）（p＜0.05）。基质凝胶侵入和迁移试验表明,RAP80 siRNA转染降低了 MCF-7细胞的侵入和迁移能力（p＜0.05）。RAP80 siRNA在凋亡相关蛋白表达中的作用:Western blot结果显示,siRNA转染上调了 Caspase-3、Apaf-1、细胞色素C和Bax的蛋白表达（p＜0.05）,下调了 Bcl-2的表达（p＜0.05）。结论:RAP80表达与雌激素受体或孕激素受体活性有关。抑制RAP80表达可以诱导乳腺癌细胞凋亡,降低MCF-7乳腺癌细胞的迁移及侵袭能力,提高了对顺铂的敏感性。肿瘤细胞可以激活保护性反应来抑制细胞周期进程,RAP80可能与顺铂诱导的DNA损伤相关并修复这种损伤。RAP80与BRCA1效应有关,它可以作为药理学调节的一个有趣目标,可以提高顺铂化疗的效率。