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利用CRISPR效应蛋白中具有连带剪切活性的一类Cas蛋白，一种全新的CRISPR/Cas检测技术在近年来发展迅速。通过加入特殊标记的ssDNA/ssRNA，能够对待检样品中核酸靶标实现荧光或可视化检测，并在amol/L水平实现对单碱基突变的精准鉴别。自2017年CRISPR/Cas13a被首次应用于核酸检测领域以来，该方法目前己在流行性疾病诊断中得到广泛应用。本文结合等温扩增技术，利用CRISPR/Cas13a、CRISPR/Cas12a，分别建立的猪瘟强弱毒CRISPR/Cas13a鉴别检测技术、非洲猪瘟CRISPR/Cas12a核酸检测技术以及RAA-LFA临场检测技术，为我国重要猪病的防控提供技术支持。
自2017年，我国开始进行猪瘟的净化工作。由于兔化弱毒疫苗的广泛使用，建立能够精确区分强毒感染猪与弱毒疫苗免疫猪的检测方法具有重要意义。Cas13a是一种RNA引导的RNase，能够专一识别RNA分子靶标。本文通过大肠杆菌原核表达及纯化，成功得到具有连带剪切活性的LwaCas13a蛋白，并针对猪瘟强毒株与弱毒株在3’非编码区的差异位点设计强弱毒特异crRNA，建立了猪瘟强弱毒CRISPR/Cas13a鉴别检测方法。结合RT-RAA等温扩增技术，显著提高了CRISPR/Cas13a检测敏感性，检出限由3×1010copies/μL降低至3×102copies/μL。该技术不仅能够准确区分标准强毒株与兔化弱毒疫苗株，并且广谱识别我国主要流行毒株2.1型。此外，利用HUDSON技术，通过向待检样品中加入EDTA及TCEP后煮沸处理，以达到失活核酸酶以及裂解病毒的目的，实现了对猪瘟病毒细胞培养物及临床组织样品的核酸免提取检测。HUDSON-RT-RAA-CRISPR/Cas13a对Shimen及HCLV细胞培养物的检出限为3.45×102copies/μL、1.77×102copies/μL，与nPCR敏感性相当，比抗原ELISA敏感性至少高100倍。HUDSON-RT-RAA-CRISPR/Cas13a同样能够精准区分Shimen株与HCLV株，在HUDSON-RT-RAA-CRISPR/Cas13a、nPCR以及ELISA检测50份猪临床样品的平行比对试验中，HUDSON-RT-RAA-CRISPR/Cas13a与nPCR和抗原ELISA的符合率分别为100.0％和92.0％。
与Cas13a家族蛋白相比，Cas12a是一种RNA引导的DNase，能够专一性的识别DNA分子靶标。因此，以CRISPR/Cas12a为基础的核酸检测方法具有稳定性高、体系简单、成本低廉等优点，已逐步取代以CRISPR/Cas13a成为该领域的代表技术。自2018年以米，非洲猪瘟疫情势头迅猛，本文基于CRISPR/Cas12a技术，建立了非洲猪瘟新型核酸检测技术。本研究采用镍柱亲和层析，成功纯化出具有连带剪切活性的AsCas12a蛋白，并对其连带剪切活性的最适反应条件进行了系统优化。利用优化的CRISPR/Cas12a连带剪切活性测定方法，针对B646L基因全长设计了55条gRNA，从中筛选出效果最好的gp72-P01、gp72-P02、gp72-N31及gp72-N34四条gRNA。结合RAA等温扩增技术，将该技术的检出限由6×108copies/μL降至6×102copics/μL。此外，结合生物素/FITC标记的报告DNA与侧流层析试纸，实现了对检测结果的可视化判定，在保持了与荧光检测仪器相同敏感性的前提下，将检测时间由1h缩短至30min。最后，在对15份血液样品和15份血清样品的检测中，与OIE推荐的PCR符合率为100％。
为建立设备的能够在基层猪场及偏远地区开展的快速便捷且不依赖仪器的非洲猪瘟临场检测方法，，本文实现了对非洲猪瘟病毒的核酸免提取等温扩增胶体金侧流试纸检测(RAA-LFA)。从收到样品到结果判定可在30min内完成，主要包括三个步骤:(1)PBS1:3稀释样品并煮沸5min;(2)37℃，10min等温扩增;(3)室温，5-10min侧流层析试纸可视化判定。通过条件优化，本方法对标准质粒的检测限为10copies/μL，比OIE推荐的PCR和商品化qPCR试剂盒敏感性高10倍。此外，自等温扩增试剂盒拆封开始，分别在1、4、8、12个月后对强阳性(105copies/μL标准质粒)、中阳性(103copies/μL标准质粒)、弱阳性(10copies/μL标准质粒)及阴性样品(双蒸水)进行了检测，除临界的弱阳性样品在四个时间点检测结果的变异系数(10.45％)略高于10％外，其余三个样品检测结果的变异系数(2.73％、4.01％、8.76％)均小于10％，表明所建立的检测方法在等温扩增试剂盒1年有效期内显示出良好的稳定性。最后，我们发现血液中某些成分对PCR扩增具有很强的抑制作用，而对RAA等温扩增影响很小，表明本文所建立的RAA等温扩增检测方法更适用于对血液样品的检测。
自2017年，我国开始进行猪瘟的净化工作。由于兔化弱毒疫苗的广泛使用，建立能够精确区分强毒感染猪与弱毒疫苗免疫猪的检测方法具有重要意义。Cas13a是一种RNA引导的RNase，能够专一识别RNA分子靶标。本文通过大肠杆菌原核表达及纯化，成功得到具有连带剪切活性的LwaCas13a蛋白，并针对猪瘟强毒株与弱毒株在3’非编码区的差异位点设计强弱毒特异crRNA，建立了猪瘟强弱毒CRISPR/Cas13a鉴别检测方法。结合RT-RAA等温扩增技术，显著提高了CRISPR/Cas13a检测敏感性，检出限由3×1010copies/μL降低至3×102copies/μL。该技术不仅能够准确区分标准强毒株与兔化弱毒疫苗株，并且广谱识别我国主要流行毒株2.1型。此外，利用HUDSON技术，通过向待检样品中加入EDTA及TCEP后煮沸处理，以达到失活核酸酶以及裂解病毒的目的，实现了对猪瘟病毒细胞培养物及临床组织样品的核酸免提取检测。HUDSON-RT-RAA-CRISPR/Cas13a对Shimen及HCLV细胞培养物的检出限为3.45×102copies/μL、1.77×102copies/μL，与nPCR敏感性相当，比抗原ELISA敏感性至少高100倍。HUDSON-RT-RAA-CRISPR/Cas13a同样能够精准区分Shimen株与HCLV株，在HUDSON-RT-RAA-CRISPR/Cas13a、nPCR以及ELISA检测50份猪临床样品的平行比对试验中，HUDSON-RT-RAA-CRISPR/Cas13a与nPCR和抗原ELISA的符合率分别为100.0％和92.0％。
与Cas13a家族蛋白相比，Cas12a是一种RNA引导的DNase，能够专一性的识别DNA分子靶标。因此，以CRISPR/Cas12a为基础的核酸检测方法具有稳定性高、体系简单、成本低廉等优点，已逐步取代以CRISPR/Cas13a成为该领域的代表技术。自2018年以米，非洲猪瘟疫情势头迅猛，本文基于CRISPR/Cas12a技术，建立了非洲猪瘟新型核酸检测技术。本研究采用镍柱亲和层析，成功纯化出具有连带剪切活性的AsCas12a蛋白，并对其连带剪切活性的最适反应条件进行了系统优化。利用优化的CRISPR/Cas12a连带剪切活性测定方法，针对B646L基因全长设计了55条gRNA，从中筛选出效果最好的gp72-P01、gp72-P02、gp72-N31及gp72-N34四条gRNA。结合RAA等温扩增技术，将该技术的检出限由6×108copies/μL降至6×102copics/μL。此外，结合生物素/FITC标记的报告DNA与侧流层析试纸，实现了对检测结果的可视化判定，在保持了与荧光检测仪器相同敏感性的前提下，将检测时间由1h缩短至30min。最后，在对15份血液样品和15份血清样品的检测中，与OIE推荐的PCR符合率为100％。
为建立设备的能够在基层猪场及偏远地区开展的快速便捷且不依赖仪器的非洲猪瘟临场检测方法，，本文实现了对非洲猪瘟病毒的核酸免提取等温扩增胶体金侧流试纸检测(RAA-LFA)。从收到样品到结果判定可在30min内完成，主要包括三个步骤:(1)PBS1:3稀释样品并煮沸5min;(2)37℃，10min等温扩增;(3)室温，5-10min侧流层析试纸可视化判定。通过条件优化，本方法对标准质粒的检测限为10copies/μL，比OIE推荐的PCR和商品化qPCR试剂盒敏感性高10倍。此外，自等温扩增试剂盒拆封开始，分别在1、4、8、12个月后对强阳性(105copies/μL标准质粒)、中阳性(103copies/μL标准质粒)、弱阳性(10copies/μL标准质粒)及阴性样品(双蒸水)进行了检测，除临界的弱阳性样品在四个时间点检测结果的变异系数(10.45％)略高于10％外，其余三个样品检测结果的变异系数(2.73％、4.01％、8.76％)均小于10％，表明所建立的检测方法在等温扩增试剂盒1年有效期内显示出良好的稳定性。最后，我们发现血液中某些成分对PCR扩增具有很强的抑制作用，而对RAA等温扩增影响很小，表明本文所建立的RAA等温扩增检测方法更适用于对血液样品的检测。