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伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV)属于疱疹病毒科(Herpesviridae)α疱疹病毒亚科(Alpha Herpesviridae)，可感染自然宿主猪以及啮齿动物、猫、狗和牛在内的其他多种哺乳动物，并引起广泛的症状。病毒能在猪体内大量增殖且在外周感觉神经元中建立潜伏感染。当外部环境改变或猪机体免疫力低下时，潜伏感染状态可被重新激活至急性感染状态，造成机体再次感染，给防治伪狂犬病带来困难。经蛋白酶体降解产生的多肽结合至抗原加工相关转运体(Transporter of antigenic peptide，TAP)，激活ATP酶，水解ATP释放能量，促使多肽被转运至内质网中与主要组织相容性复合体Ⅰ类分子(MajorhistocompatibilitycomplexclassⅠ，MHCⅠ)形成异源三聚体复合物(Peptide-MHC-complex，pMHCⅠ)，穿过内质网经高尔基体展示到细胞表面，细胞毒性T淋巴细胞(CytotoxicityT lymphocyte，CTL)通过识别该复合体裂解被感染的细胞。多肽装载复合物(Peptide loading complex，PLC)由TAP、Tapasin、钙联蛋白(Calnexin，CNX)、钙网蛋白(Calreticulin，CRT)和内质网蛋白(Endoplasmic reticulum protein，ERp)等分子组成。在TAP转运抗原肽的过程中，Tapasin、CNX、CRT和ERp促进TAP与MHCⅠ分子相互作用，完成抗原肽的转运。因此，PLC中任一成分的缺失或异常可能导致与TAP结合的多肽无法与MHCⅠ分子有效装配，影响细胞表面MHCⅠ分子的展示。以往的研究证明PRV可产生免疫逃逸，表现在感染PRV的宿主细胞表面猪白细胞抗原Ⅰ类分子(SwineleukocyteantigenclassⅠmolecule，SLAⅠ)(猪源MHCⅠ分子)的展示减少，但具体机制尚不完全清楚。TAP是疱疹病毒影响SLAⅠ分子抗原递呈过程中的主要靶点。关于PRV影响TAP肽转运的研究除pUL49.5以外鲜有报道。因此，本研究利用生物信息学方法筛选影响TAP肽转运的PRV蛋白，并对其功能进行验证。
1、应用生物信息学初步筛选影响TAP肽转运的伪狂犬病病毒蛋白
为初步筛选出可能影响TAP肽转运的PRV蛋白，利用在线分析软件分析单纯疱疹病毒1型(Herpes simplex virus type 1，HSV-1)ICP47、牛疱疹病毒1型(Bovine herpesvirus type 1，BHV-1)UL49.5、人巨细胞病毒(Human cytomegalovirus，HCMV)US6、爱泼斯坦-巴尔病毒(Epstein-Barr virus，EBV)BNLF2a、牛痘病毒(Cowpox virus，CPXV)CPXV012等5种已知TAP抑制剂的理化性质、疏水性、跨膜域、磷酸化修饰、亚细胞定位、信号肽、二级结构等，初步筛选出与几种TAP抑制剂结构相似的PRV蛋白并进行同源比对及三级结构预测和分析比较，最终筛选出与TAP抑制剂BHV-1UL49.5结构相似的PRVpUL49.5，以及与HCMVUS6结构相似的PRVpUS6和pUL44。
2、伪狂犬病病毒US6和UL44基因真核表达重组质粒的构建与表达
为验证利用生物信息学方法筛选出的PRVpUS6和pUL44在细胞内的表达，利用同源重组法将US6和UL44基因产物分别连接到真核表达载体pCDNA3.1(+)-HA和pCAGGS-HA上，成功获得真核表达重组质粒pUS6-HA和pUL44-HA。常规脂质体法转染至PK-15细胞，在转染后第6、12、18和24h收取不同组别细胞以提取RNA，转染后30h收取细胞以提取蛋白液。用qRT-PCR和Westernblot分别检测PRVUS6和UL44在转录和翻译水平的表达。结果显示，PRVUS6和UL44mRNA水平随时间的推移呈逐渐递增趋势，且pUS6和pUL44在细胞中均能表达与预期相符的蛋白质，为研究筛选蛋白参与病毒免疫逃逸过程机制奠定基础。
3、影响TAP肽转运的伪狂犬病病毒pUS6和pUL44的功能鉴定
为鉴定候选蛋白PRVpUL44和pUS6是否参与病毒免疫逃逸及其机制，利用qRT-PCR和Westernblot分别在mRNA和蛋白水平分析pUS6和pUL44对总SLAⅠ分子及细胞表面SLAⅠ分子的影响。结果显示，pUS6和pUL44在mRNA和蛋白水平均能明显下调细胞总SLAⅠ分子，且在蛋白水平下调细胞表面SLAⅠ分子。为验证pUS6和pUL44影响SLAⅠ分子是否依赖于多肽从细胞质进入内质网的转运受到抑制，利用qRT-PCR和Westernblot检测细胞在表达候选蛋白后分别对TAP及与之相关的Tapasin、CNX、CRT和ERp等分子的影响。结果显示，pUS6对TAP1、TAP2及Tapasin分子转录具有抑制作用，且没有剂量依赖性。对TAP1分子的蛋白水平及剂量依赖性的检测进一步验证了该结果，pUL44对PLC任一成分均无抑制作用。为进一步验证pUS6作用于TAP的机制，利用ATP-琼脂糖凝胶结合实验检测TAP1对ATP的结合活性，结果显示，表达PRVpUS6可以抑制TAP1与ATP的结合。
根据TAP和Tapasin在MHCⅠ分子抗原递呈过程中的作用，结合以上结果提示PRVpUS6可能通过抑制ATP与TAP1的结合使抗原肽的转运缺乏能量，导致与TAP1结合的多肽无法与内质网中SLAⅠ分子结合形成复合物，最终造成TAP与Tapasin的合成受阻，影响细胞表面SLAⅠ分子的展示及CD8+T分子对感染细胞的识别而逃避宿主免疫监视。pUL44下调细胞SLAⅠ分子参与病毒免疫逃逸的机制还有待进一步研究。这些发现不仅有助于进一步研究PRV编码蛋白在病毒免疫逃逸中的功能，同时也为深入了解病毒感染和宿主之间的相互作用以及发现新的抗病毒靶点提供理论支持。
1、应用生物信息学初步筛选影响TAP肽转运的伪狂犬病病毒蛋白
为初步筛选出可能影响TAP肽转运的PRV蛋白，利用在线分析软件分析单纯疱疹病毒1型(Herpes simplex virus type 1，HSV-1)ICP47、牛疱疹病毒1型(Bovine herpesvirus type 1，BHV-1)UL49.5、人巨细胞病毒(Human cytomegalovirus，HCMV)US6、爱泼斯坦-巴尔病毒(Epstein-Barr virus，EBV)BNLF2a、牛痘病毒(Cowpox virus，CPXV)CPXV012等5种已知TAP抑制剂的理化性质、疏水性、跨膜域、磷酸化修饰、亚细胞定位、信号肽、二级结构等，初步筛选出与几种TAP抑制剂结构相似的PRV蛋白并进行同源比对及三级结构预测和分析比较，最终筛选出与TAP抑制剂BHV-1UL49.5结构相似的PRVpUL49.5，以及与HCMVUS6结构相似的PRVpUS6和pUL44。
2、伪狂犬病病毒US6和UL44基因真核表达重组质粒的构建与表达
为验证利用生物信息学方法筛选出的PRVpUS6和pUL44在细胞内的表达，利用同源重组法将US6和UL44基因产物分别连接到真核表达载体pCDNA3.1(+)-HA和pCAGGS-HA上，成功获得真核表达重组质粒pUS6-HA和pUL44-HA。常规脂质体法转染至PK-15细胞，在转染后第6、12、18和24h收取不同组别细胞以提取RNA，转染后30h收取细胞以提取蛋白液。用qRT-PCR和Westernblot分别检测PRVUS6和UL44在转录和翻译水平的表达。结果显示，PRVUS6和UL44mRNA水平随时间的推移呈逐渐递增趋势，且pUS6和pUL44在细胞中均能表达与预期相符的蛋白质，为研究筛选蛋白参与病毒免疫逃逸过程机制奠定基础。
3、影响TAP肽转运的伪狂犬病病毒pUS6和pUL44的功能鉴定
为鉴定候选蛋白PRVpUL44和pUS6是否参与病毒免疫逃逸及其机制，利用qRT-PCR和Westernblot分别在mRNA和蛋白水平分析pUS6和pUL44对总SLAⅠ分子及细胞表面SLAⅠ分子的影响。结果显示，pUS6和pUL44在mRNA和蛋白水平均能明显下调细胞总SLAⅠ分子，且在蛋白水平下调细胞表面SLAⅠ分子。为验证pUS6和pUL44影响SLAⅠ分子是否依赖于多肽从细胞质进入内质网的转运受到抑制，利用qRT-PCR和Westernblot检测细胞在表达候选蛋白后分别对TAP及与之相关的Tapasin、CNX、CRT和ERp等分子的影响。结果显示，pUS6对TAP1、TAP2及Tapasin分子转录具有抑制作用，且没有剂量依赖性。对TAP1分子的蛋白水平及剂量依赖性的检测进一步验证了该结果，pUL44对PLC任一成分均无抑制作用。为进一步验证pUS6作用于TAP的机制，利用ATP-琼脂糖凝胶结合实验检测TAP1对ATP的结合活性，结果显示，表达PRVpUS6可以抑制TAP1与ATP的结合。
根据TAP和Tapasin在MHCⅠ分子抗原递呈过程中的作用，结合以上结果提示PRVpUS6可能通过抑制ATP与TAP1的结合使抗原肽的转运缺乏能量，导致与TAP1结合的多肽无法与内质网中SLAⅠ分子结合形成复合物，最终造成TAP与Tapasin的合成受阻，影响细胞表面SLAⅠ分子的展示及CD8+T分子对感染细胞的识别而逃避宿主免疫监视。pUL44下调细胞SLAⅠ分子参与病毒免疫逃逸的机制还有待进一步研究。这些发现不仅有助于进一步研究PRV编码蛋白在病毒免疫逃逸中的功能，同时也为深入了解病毒感染和宿主之间的相互作用以及发现新的抗病毒靶点提供理论支持。