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猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)在全世界范围流行，严重影响了养猪业的健康发展。目前对于猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)还没有特效药物进行控制，接种疫苗引起的抗体依赖性增强(ADE)作用更有利于病毒的增殖。近年来，国内外学者开展了中药抗PRRSV的试验研究，但体外试验多用MA-104和Marc-145细胞，这两个细胞株来源于猴的肾细胞，而PRRSV主要感染的靶细胞为猪肺泡巨噬细胞，两者差异较大。本试验使用永生化的猪肺泡巨噬细胞(3D4/21/CD163)作为靶细胞，研究IRPS抗PRRSV的主要作用机制。
试验一:PRRSV实时定量PCR检测方法的建立。为了在试验过程中对PRRSV的含量进行简单快速的检测，建立了PRRSV实时荧光定量PCR检测方法，此方法根据PRRSV-N基因设计一条长度为221bp的特异性荧光引物，通过构建标准质粒浓度为1×1010copies/μL，对此反应程序进行优化，包括引物浓度、引物体积和退火变性温度等。然后利用不同浓度的标准质粒对此检测方法的敏感性、重复性和特异性进行评价。结果显示该方法具有较好的特异性，能检测到的最低质粒浓度为1×101copies/μL，高于普通PCR10倍左右，说明此方法具有良好的敏感性。该荧光检测方法的建立为后续试验细胞中PRRSV的拷贝数进行实时监测奠定了基础。
试验二:板蓝根多糖(IRPS)对PRRSV体外作用研究。用永生化的传代猪肺泡巨噬细胞(3D4/21/CD163)作为靶细胞研究IRPS抗PRRSV的最佳作用方式及抑制其增殖的环节。分别以预防作用、直接杀灭作用和治疗作用确定IRPS抑制PRRSV增殖的最佳作用方式和作用浓度;从IRPS对PRRSV的吸附、侵入环节的影响确定IRPS抑制病毒复制的环节;用荧光定量PCR和问接免疫荧光对IRPS抗PRRSV作用进行验证。结果显示:当IRPS浓度为0.0625mg/mL时对PRRSV的直接杀灭作用(p＜0.0001)和预防作用(p＜0.001)效果最好，IRPS主要作用于病毒复制的侵入环节(p＜0.0001)。
试验三:板蓝根多糖对PRRSV感染后产生细胞因子的影响。本试验设置空白对照组、病毒对照组和IPRS处理组，以试验二筛选出的IRPS的最佳作用方式和最佳作用环节处理细胞，然后用荧光定量PCR和ELISA试剂盒测定不同处理组之间细胞因子的转录水平和蛋白分泌情况。结果显示:细胞因子的转录水平与蛋白表达水平具有相似的趋势。病毒对照组的炎性因子表达水平显著高于空白对照组(p＜0.0001)，IRPS处理组IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α炎性因子表达水平显著低于病毒对照组(p＜0.0001)，说明IRPS能够降低3D4/21/CD163细胞感染PRRSV后炎性因子的分泌。IL-10与其他炎性因子的分泌结果相反，病毒对照组显著低于空白对照组(p＜0.0001)，IRPS处理组IL-10的表达显著高于病毒对照组(p＜0.0001)但低于空白对照组(p＜0.0001)，说明IL-10的高表达能够抑制IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α等炎性因子的分泌。结果表明IRPS对感染PRRSV的3D4/21/CD163细胞分泌的细胞因子具有免疫调节作用。
试验四:板蓝根多糖对感染PRRSV细胞的TLR作用研究。与试验三处理细胞方式相同，用荧光定量PCR方法检测细胞中不同时间段TLR3、TLR4、TLR7和TLR9的转录水平。结果显示，病毒感染后TLR3、TLR4、TLR7和TLR9的表达有时相差异性，而IPRS处理后，可以双向调节PRRSV感染细胞TLR受体的表达，过高则抑制，过低则促进。IRPS处理组与病毒对照组相比TLR3和TLR4在24h的转录水平显著性上调，TLR4的蛋白表达结果进一步验证了其转录水平。由于这两个受体参与IL-10的表达，可能激活下游信号通路进而引起IL-10分泌的增加，IPRS处理组的IL-10表达水平也显著高于病毒对照组，但TLR7和TLR9转录水平IPRS处理组和病毒对照组在24h的转录水平并无显著性差异。提示IRPS可能通过上调TLR3和TLR4的转录，进而促进IL-10的分泌，抑制其他细胞因子的分泌，发挥双向免疫调节作用。
试验一:PRRSV实时定量PCR检测方法的建立。为了在试验过程中对PRRSV的含量进行简单快速的检测，建立了PRRSV实时荧光定量PCR检测方法，此方法根据PRRSV-N基因设计一条长度为221bp的特异性荧光引物，通过构建标准质粒浓度为1×1010copies/μL，对此反应程序进行优化，包括引物浓度、引物体积和退火变性温度等。然后利用不同浓度的标准质粒对此检测方法的敏感性、重复性和特异性进行评价。结果显示该方法具有较好的特异性，能检测到的最低质粒浓度为1×101copies/μL，高于普通PCR10倍左右，说明此方法具有良好的敏感性。该荧光检测方法的建立为后续试验细胞中PRRSV的拷贝数进行实时监测奠定了基础。
试验二:板蓝根多糖(IRPS)对PRRSV体外作用研究。用永生化的传代猪肺泡巨噬细胞(3D4/21/CD163)作为靶细胞研究IRPS抗PRRSV的最佳作用方式及抑制其增殖的环节。分别以预防作用、直接杀灭作用和治疗作用确定IRPS抑制PRRSV增殖的最佳作用方式和作用浓度;从IRPS对PRRSV的吸附、侵入环节的影响确定IRPS抑制病毒复制的环节;用荧光定量PCR和问接免疫荧光对IRPS抗PRRSV作用进行验证。结果显示:当IRPS浓度为0.0625mg/mL时对PRRSV的直接杀灭作用(p＜0.0001)和预防作用(p＜0.001)效果最好，IRPS主要作用于病毒复制的侵入环节(p＜0.0001)。
试验三:板蓝根多糖对PRRSV感染后产生细胞因子的影响。本试验设置空白对照组、病毒对照组和IPRS处理组，以试验二筛选出的IRPS的最佳作用方式和最佳作用环节处理细胞，然后用荧光定量PCR和ELISA试剂盒测定不同处理组之间细胞因子的转录水平和蛋白分泌情况。结果显示:细胞因子的转录水平与蛋白表达水平具有相似的趋势。病毒对照组的炎性因子表达水平显著高于空白对照组(p＜0.0001)，IRPS处理组IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α炎性因子表达水平显著低于病毒对照组(p＜0.0001)，说明IRPS能够降低3D4/21/CD163细胞感染PRRSV后炎性因子的分泌。IL-10与其他炎性因子的分泌结果相反，病毒对照组显著低于空白对照组(p＜0.0001)，IRPS处理组IL-10的表达显著高于病毒对照组(p＜0.0001)但低于空白对照组(p＜0.0001)，说明IL-10的高表达能够抑制IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α等炎性因子的分泌。结果表明IRPS对感染PRRSV的3D4/21/CD163细胞分泌的细胞因子具有免疫调节作用。
试验四:板蓝根多糖对感染PRRSV细胞的TLR作用研究。与试验三处理细胞方式相同，用荧光定量PCR方法检测细胞中不同时间段TLR3、TLR4、TLR7和TLR9的转录水平。结果显示，病毒感染后TLR3、TLR4、TLR7和TLR9的表达有时相差异性，而IPRS处理后，可以双向调节PRRSV感染细胞TLR受体的表达，过高则抑制，过低则促进。IRPS处理组与病毒对照组相比TLR3和TLR4在24h的转录水平显著性上调，TLR4的蛋白表达结果进一步验证了其转录水平。由于这两个受体参与IL-10的表达，可能激活下游信号通路进而引起IL-10分泌的增加，IPRS处理组的IL-10表达水平也显著高于病毒对照组，但TLR7和TLR9转录水平IPRS处理组和病毒对照组在24h的转录水平并无显著性差异。提示IRPS可能通过上调TLR3和TLR4的转录，进而促进IL-10的分泌，抑制其他细胞因子的分泌，发挥双向免疫调节作用。