硫酸软骨素（Chondroitin sulfate,CS）是一种硫酸化的糖胺聚糖,参与软骨再生、炎症反应、神经系统发育和损伤修复等多种生物学功能。其糖链是由1,4-连接的N-乙酰-β-D-半乳糖胺（β-D-Gal NAc）和1,3-连接的β-D-葡萄糖醛酸（β-D-Glc A）重复二糖单元构成。糖链上硫酸基团的数量和位点对硫酸软骨素的生物活性起重要的调控作用,根据二糖重复单元上不同的硫酸化修饰模式,硫酸软骨素主要分为4-硫酸软骨素（CS-A）、6-硫酸软骨素（CS-C）、2,6-硫酸软骨素（CS-D）、4,6-硫酸软骨素（CS-E）等亚型。由于糖链长度、硫酸化修饰、异构化修饰等因素使硫酸软骨素的结构复杂、分子量不均一,因此对硫酸软骨素寡糖结构及神经调节的研究逐渐引起人们的重视。目前天然的硫酸软骨素主要来源于动物软骨组织中,因其构型复杂,难以获得化学结构可控、分子量均一的硫酸软骨素寡糖。大肠杆菌K4（Escherichia coli O5:K4:H4）的主要代谢产物为果糖化软骨素,可作为硫酸软骨素前体,通过脱果糖处理后可获得与软骨素相同的糖链结构,以其为原料有望制备得到非动物来源的硫酸软骨素寡糖及其衍生物。本论文采用酶法降解和酶法硫酸化两步实现链尺寸和硫酸化位点可控的硫酸软骨素寡糖,进一步对软骨素四糖进行荧光标记。首先用硫酸软骨素降解酶对脱果糖K4（Defructosylated K4,DK4）进行降解,实现软骨素寡糖的制备;然后在硫酸软骨素磺基转移酶作用下实现不同位点硫酸化;最后合成香豆素衍生物荧光剂B,与软骨素四糖发生还原胺化反应,实现软骨素寡糖的荧光标记。主要研究结果如下:（1）通过大肠杆菌K4发酵得K4多糖,纯化及脱果糖处理后得纯度较高的DK4,经SEC-MALS测定得Mw为27.79 k Da,PDI为1.247,并利用红外和核磁共振确定其结构。大肠杆菌低温诱导表达硫酸软骨素降解酶AC和ABC,经镍柱纯化SDS-PAGE鉴定,测得其纯度高于95%,分子量分别约为75 k Da和100 k Da。以DK4为底物进行降解,优化降解条件,通过Bio-Gel P-2凝胶色谱法和高效液相色谱分离得到链尺寸可控的软骨素四糖、六糖、八糖。（2）通过优化昆虫细胞杆状病毒系统表达硫酸软骨素4-O-磺基转移酶（Chondroitin sulfate 4-O-sulfotransferase,CS4OST）和硫酸软骨素6-O-磺基转移酶（Chondroitin sulfate6-O-sulfotransferase,CS6OST）,纯化后经SDS-PAGE鉴定并测得其分子量分别约为48k Da和58 k Da。以软骨素寡糖为底物,3’-磷酸腺苷-5’-磷酰硫酸（3’-phosphoadenosine-5’-phosphosulfate,PAPS）为磺基供体,通过优化硫酸化修饰的酶促反应条件,生成链尺寸和硫酸化位点可控的CS-A和CS-C亚型。（3）以二乙氨基-水杨醛和硝基乙酸乙酯为原料合成荧光剂B,软骨素四糖与荧光剂B通过还原胺化反应合成荧光标记率为3.64%的四糖荧光标记物,采用荧光分光光度计、红外、紫外等手段进行表征。考察p H的影响、细胞毒性及细胞摄取能力,结果表明,四糖荧光标记物可以在细胞内稳定存在并被细胞选择性摄取。