【摘 要】
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角蛋白酶是一种能特异性降解角蛋白底物的蛋白酶,在制革和化妆品行业已经展现优势。来自枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）重组表达的角蛋白酶KerZ1在最适反应温度（60℃）下可以高效水解角蛋白底物,但在低于60℃的中低温环境下催化活性较低,难以满足皮革脱毛工艺和化妆品对于低温活性的需求。为此,本研究通过定向进化结合模拟计算提升了角蛋白酶KerZ1的低温催化活性,并对其mRNA的5’-U
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角蛋白酶是一种能特异性降解角蛋白底物的蛋白酶,在制革和化妆品行业已经展现优势。来自枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）重组表达的角蛋白酶KerZ1在最适反应温度（60℃）下可以高效水解角蛋白底物,但在低于60℃的中低温环境下催化活性较低,难以满足皮革脱毛工艺和化妆品对于低温活性的需求。为此,本研究通过定向进化结合模拟计算提升了角蛋白酶KerZ1的低温催化活性,并对其mRNA的5’-UTR表达元件进行了优化,为提高角蛋白酶KerZ1在制革和化妆品领域的实用性打下了基础,也为其他工业酶的分子改造提供了可借鉴的思路。主要内容及结论如下:（1）通过定向进化筛选得到一个具有低温活性优势的角蛋白酶KerZ1突变体T3I/V45D/S100D。其在最适温度60℃、中等温度40℃和低温20℃下的比酶活与野生酶KerZ1相比分别提升了25.96%、29.20%与112.91%。突变体T3I/V45D/S100D的半衰期与原始酶基本一致,其热稳定性几乎没有损失。该突变体低温催化活性的提升机制可能来自于活性口袋内的负电荷增加以及酶分子表面静电势的改变。（2）通过同源序列比对和虚拟氨基酸突变向角蛋白酶KerZ1的Loop区引入定点突变进行柔性改造。并将引入柔性环Loop 13的3个正向氨基酸突变进行复合,构建了复合突变体T210S/N211S/T212G。酶学性质测定表明,复合突变体在40℃和20℃条件下的比酶活相比KerZ1分别提升45.68%和85.74%。该突变体低温活性提升机制主要来自于关键Loop环间的氢键减少,但这也导致了突变体在最适温度下有一定的热稳定性损失。（3）通过分析角蛋白酶KerZ1的Loop区各残基的均方根浮动（RMSF）,对4个与低温活性潜在相关位点进行饱和突变,筛选到一个低温活性优势突变体V26K。与原始酶相比其在40℃和20℃下的比酶活提高了22.60%和129.65%,酶的催化效率也得到了4.61%的提高。（4）通过对得到的角蛋白酶低温催化活性优势突变体进行组合,构建了4个复合突变体。其中突变体T3I/V45D/S100D/T210S/N211S/T212G的半衰期较KerZ1提升了6.80%,且在20℃-60℃的比酶活较KerZ1提升234.18%、70.56%与31.87%。同时,其在40℃的催化效率(kcat/Km)达到30155.30 g-1·L·s-1,为本研究中角蛋白酶低温催化活性突变体的最高水平。（5）通过吉布斯自由能计算和序列简化策略优化角蛋白酶复合突变体T3I/V45D/S100D/T210S/N211S/T212G表达元件的mRNA 5’-UTR序列。筛选得到的突变体KerZ1-LtAB-C4-Sim3C经摇瓶水平发酵24 h,在60℃的酶活达到204.44±1.19 k U·m L-1,较突变体T3I/V45D/S100D/T210S/N211S/T212G和KerZ1分别提升了54.02%和85.57%。在随后的5 L发酵罐水平发酵验证中,重组菌株B.subtilis WB600 KerZ1-LtAB-C4-Sim3C的60℃和40℃酶活分别为797.05±20.86 k U·m L-1和349.55±5.02 k U·m L-1,与原始菌株相比分别提高了42.98%和80.79%,其产酶能力和酶的低温催化活性优势得到了充分验证。
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