【摘 要】
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中国仓鼠卵巢（Chinese hamster ovary,CHO）细胞是生物制药领域表达各种治疗性蛋白质和抗体的最广泛使用的表达系统。随机整合是传统的构建重组细胞株的方法,虽然该技术更为成熟、简便,但所构细胞的整合位点具有不确定性,容易导致高水平的克隆变异,且构建过程耗时长、成本高、构建效率低。通过位点特异性整合方法构建的表达细胞株具有可预测性,能有效降低克隆变异水平,缩短稳定重组表达细胞株的构建
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中国仓鼠卵巢（Chinese hamster ovary,CHO）细胞是生物制药领域表达各种治疗性蛋白质和抗体的最广泛使用的表达系统。随机整合是传统的构建重组细胞株的方法,虽然该技术更为成熟、简便,但所构细胞的整合位点具有不确定性,容易导致高水平的克隆变异,且构建过程耗时长、成本高、构建效率低。通过位点特异性整合方法构建的表达细胞株具有可预测性,能有效降低克隆变异水平,缩短稳定重组表达细胞株的构建周期,但通过此方法构建稳定表达株,需要具有信息明确的稳定位点。课题组前期通过慢病毒感染随机整合Zsgreen1报告基因的方式获得了若干具有潜在稳定表达能力的CHO-K1细胞株。本研究以上述细胞为研究材料,获得多个稳定表达位点信息,并选择其中一个位点,通过CRISPR/Cas9技术构建含有Bxb1重组酶系统着陆垫的稳定平台细胞系,并利用Bxb1重组酶介导的基因重组实现外源基因的定点整合。（1）以课题组前期通过慢病毒感染随机整合了Zsgreen1报告基因的具有潜在稳定表达位点的CHO-K1细胞株为研究对象,分别贴壁培养20代、悬浮培养50代,利用倒置荧光显微镜及流式细胞仪分析绿色荧光标签Zsgreen1蛋白的表达情况,获得4株能稳定表达Zsgreen1蛋白的细胞:CHO-K1-1d2、CHO-K1-1b7、CHO-K1-2f7及CHO-K1-2d9细胞。（2）利用染色体步移技术分析并验证上述四株细胞中Zsgreen1基因的整合位点,获得4个CHO细胞中稳定表达位点所在基因组信息:NW-003614092.1第1159463～1159467碱基间（1d2）、NW-003613781.1第1497183～1497187碱基间（1b7）、NW-003613756.1第101420～101424碱基间（2f7）及NW-003614889.1第103431～103435碱基间（2d9）。（3）通过CCTOP CRISPR/Cas9在线预测系统分析基因组NW-003613781.1上第1497083～1497287碱基范围的基因序列,获得CRISPR/Cas9系统能识别的靶序列:5’-GCACTATATGCACATGCCAGTGG-3’,构建靶向该序列的sgRNA表达质粒,与Cas9蛋白表达质粒共转染于CHO-K1细胞,经T7E1酶切及测序验证,sgRNA能够引导Cas9蛋白在目标靶点断裂DNA双链,验证了该位点的可编辑性。（4）利用CRISPR/Cas9技术介导的同源定向修复,通过共转染sgRNA表达质粒、Cas9蛋白表达质粒及增强型绿色荧光蛋白（Enhanced green fluorescent protein,EGFP）供体质粒,在目标靶点处定点整合携带Bxb1整合酶系统attP特异位点的EGFP基因及嘌呤霉素抗性基因的表达盒。通过嘌呤霉素筛选、流式细胞分选及PCR验证获得5株发生定点整合的阳性克隆株:纯合子K1-1b7-EGFP-17,杂合子K1-1b7-EGFP-29、K1-1b7-EGFP-35、K1-1b7-EGFP-37及K1-1b7-EGFP-43。选择K1-1b7-EGFP-17、K1-1b7-EGFP-29细胞悬浮培养50代次,利用流式细胞仪分析EGFP蛋白表达情况,发现所选细胞均能稳定表达EGFP蛋白,表明成功建立含有Bxb1整合酶着陆垫（Landing pad,LP）的可用于位点特异性重组的稳定平台细胞系。（5）构建含有Bxb1整合酶识别的attB特异位点的IFNβ-HSA融合蛋白供体质粒,利用attP与attB位点间的DNA重组,定点整合IFNβ-HSA融合蛋白基因及博来霉素抗性基因表达盒,经博来霉素筛选、流式细胞分选、Dolt blot、PCR验证及Western blot获得6株成功发生DNA重组并表达IFNβ-HSA融合蛋白的阳性克隆株:K1-1b7-IFNβ-HSA-2、K1-1b7-IFNβ-HSA-11、K1-1b7-IFNβ-HSA-20、K1-1b7-IFNβ-HSA-26、K1-1b7-IFNβ-HSA-27及K1-1b7-IFNβ-HSA-33。选择K1-1b7-IFNβ-HSA-26、K1-1b7-IFNβ-HSA-27细胞进行批次培养检测IFNβ-HSA融合蛋白的表达水平,发现蛋白积累量分别为9.41mg·L-1及13.85 mg·L-1。
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